定向结构软骨支架材料修复运动性关节软骨损伤.doc

www.CRTER.org赵霞，等. 定向结构软骨支架材料修复运动性关节软骨损伤定向结构软骨支架材料修复运动性关节软骨损伤赵 霞1，郭秋林2 (1晋中学院体育学院，山西省晋中市 030619；2山西医科大学体育教学部，山西省太原市 030001)引用本文：赵霞，郭秋林. 定向结构软骨支架材料修复运动性关节软骨损伤J.中国组织工程研究，2017，21(2):209-214.DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.02.009 ORCID: 0000-0003-3809-0497(赵霞)文章快速阅读：赵霞，女，1981年生，山西省太原市人，汉族，2007年天津中医药大学毕业，博士，讲师，主要从事针灸推拿学方面的研究。 中图分类号:R318文献标识码:A文章编号:2095-4344(2017)02-00209-06稿件接受：2016-12-13Zhao Xia, M.D., Lecturer, School of Sport of Jinzhong University, Jinzhong 030619, Shanxi Province, China定向结构软骨支架制备及修复运动性关节软骨损伤非定向支架组植入非定向支架(n=24)。定向结构软骨支架植入能促进大白兔运动关节软骨损伤部位修复。(1) 扫描电镜；(2) CT；(3)苏木精-伊红染色。48只大白兔建立运动关节损伤模型，随机分组。定向支架组植入定向支架(n=24)。制备定向结构软骨支架材料。文题释义：运动损伤：指运动过程中发生的各种损伤。其损伤部位与运动项目以及专项技术特点有关。如体操运动员受伤部位多是腕、肩及腰部，与体操动作中的支撑、转肩、跳跃、翻腾等技术有关。同时，运动前不做准备活动或准备活动不充分，身体状态不佳，缺乏适应环境的训练，以及教学、竞赛工作组织不当。运动损伤中急性多于慢性，急性损伤治疗不当、不及时或过早参加训练等原因可转化为慢性损伤。苏木精-伊红染色：为石蜡切片技术里常用的染色法之一。苏木精染液为碱性，主要使细胞核内的染色质与胞质内的核酸着紫蓝色；伊红为酸性染料，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。苏木精-伊红染色法是组织学、胚胎学、病理学教学与科研中最基本、使用最广泛的技术方法。摘要背景：软骨支架材料虽然在运动关节软骨损伤中发挥了重要的作用，但是在实际开展过程中仍受到较多的限制，导致组织工程化软骨修复达不到预期目标。目的：探讨定向结构软骨支架材料制备方法及在大白兔运动关节软骨损伤中的修复效果。方法：利用温度梯度热诱导相分离技术制备定向结构软骨支架材料，采用京尼平完成对软骨支架材料的交联，并测定支架材料的物理、力学性能。48只大白兔建立运动关节软骨损伤模型，随机将大白兔分为非定向支架组和定向支架组(n=24)，分别于运动关节软骨损伤处植入非定向支架和定向支架，6，12，24周后取材，比较2种支架在大白兔运动关节损伤中的修复效果。结果与结论：扫描电镜观察：定向支架组纵切面上可见排列相对整齐的微管样结构，且方向一致；而非定向支架组纵切面与横切面表现为多孔蜂窝状结构；弹性模量：定向支架组支架材料弹性模量显著高于非定向支架组(P 0.05)；ODriscoll量表评分：定向支架组大白兔术后6，12，24周显微CT下ODriscoll量表评分显著高于非定向支架组(P 0.05)；CT扫描：术后24周定向支架组大白兔CT下三维重建可见缺损部位平坦、光滑，冠状面二维扫面可见新生类软骨厚度与周围正常骨十分接近；非定向组大白兔3D下显示软骨表面比较平整，冠状面2D显示修复软骨与正常软骨基本相同；苏木精-伊红染色：定向支架组术后24周缺损部位消失，软骨细胞呈垂直方向排列；非定向支架组术后24周缺损部位存在典型软骨陷窝，与周围软骨组织存在差异；结果提示，采用温度梯度热诱导相分离技术制备的定向微管结构软骨支架具有良好的物理、力学性能，将其植入大白兔运动关节损伤软骨中能促进损伤部位修复，获得理想的机械力学性能。关键词：生物材料；软骨生物材料；定向结构；软骨支架材料；软骨损伤；化学脱细胞；机械力学性能；山西省自然科学基金主题词：支架；软骨；组织学；生物力学；组织工程基金资助：山西省自然科学基金计划资助项目(2014010023)3 P.O.Box 1200,Shenyang 110004 211ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAHDirectional cartilage scaffold for the repair of articular cartilage injury caused by exercise Zhao Xia1, Guo Qiu-lin2 (1School of Sport of Jinzhong University, Jinzhong 030619, Shanxi Province, China; 2Department of Physical Education, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China)AbstractBACKGROUND: Cartilage scaffold plays an important role in articular cartilage injury, but it is still restricted in practice, leading to the repair failure using tissue-engineered cartilage.OBJECTIVE: To explore the preparation method of cartilage scaffold with directional structure and its repairing effect in cartilage injury of rabbits.METHODS: Directional cartilage scaffolds were prepared by temperature gradient induced phase separation technique. The cross-linking of cartilage scaffold was completed with genipin. The physical and mechanical properties of scaffolds were determined. Forty-eight white rabbits were modeled into exercised-induced articular cartilage injury and equivalently randomized into two groups, followed by implantation of non-directional or directional scaffolds. Samples were collected at postoperative 6, 12 and 24 weeks to compare the repair effect of two scaffolds on rabbit joint injury.RESULTS AND CONCLUSION: Scanning electron microscope showed that the regular microstructures on the longitudinal section of directional scaffolds were aligned in the same direction, while the longitudinal and transverse planes of the non-directional scaffolds showed porous honeycomb structures. The elastic modulus of the directional scaffold was significantly higher than that of the non-directional scaffold (P 0.05). ODriscoll histological scores in the directional scaffold group were significantly higher than those in the non-directional scaffold group at 6, 12 and 24 weeks postoperatively (P 0.05). At postoperative 24 weeks, in the directional scaffold group, the three-dimensional reconstruction of the rabbit defect region was flat and smooth, and coronal two-dimensional scanning showed the cartilage thickness of the newborn cartilage was very close to that of the normal bone; the cartilage surface in the non-directional rabbits was flat under three-dimensional CT, and coronal two-dimensional scanning showed that the repaired cartilage was almost the same as the normal cartilage. Hematoxylin-eosin staining showed that at 24 weeks postoperatively, the defect site disappeared and the cartilage cells arranged in the vertical direction in the directional scaffold group. There were typical cartilage lacunae at the defect site in the non-directional scaffold group at 24 weeks postoperatively. Our findings suggest that the directional cartilage scaffold prepared using temperature gradient induced phase separation technique holds good physical and mechanical properties, and its implantation into the rabbit articular cartilage injury induced by exercise can promote the injury repair to obtain ideal mechanical properties.Subject headings: Stents; Cartilage; Histology; Biomechanics; Tissue EngineeringFunding: the Natural Science Foundation of Shanxi Province, No. 2014010023Cite this article: Zhao X, Guo QL. Directional cartilage scaffold for the repair of articular cartilage injury caused by exercise. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2017;21(2):209-214. 0 引言 Introduction由于人体软骨位置相对特殊，该部位缺乏血管，当软骨部位受到损伤后很难通过自身能力修复。常规方法主要以药物治疗、手术治疗为主，这些方法虽然能缓解软骨损伤部位症状，但是难以达到预期的修复效果。软骨组织工程技术是近年来使用较多的一种新型的技术，包括了种子细胞、支架材料及生物因子三大部分1-2。目前，尽管许多学者对软骨组织修复进行了许多研究，但是研究内容相对较浅，再加上由于对机体软骨组织结构、力学特性的缺乏认识，导致修复技术难以在临床推广3-4。相关研究显示，实验中采用人工方法能清除软骨组织中的抗原成分，从而获得纯度相对较高的活性成分，将其植入力学的支架材料中具备良好的生物相容性，将支架植入软骨缺损中能促进缺损部位修复5-6。基于上述理论看出，模拟人体正常关节软骨定向排列结构，在特点的诱导条件下能促进关节软骨缺损的修复和新生软骨的生成7-8。目前，临床上对于定向软骨支架的研究更多的建立在体外成骨构建基础上，对于体内研究相对较少。因此，采用软骨基质材料制备定向结构软骨支架材料并将其运用于大白兔运动关节软骨修复中具有重要的意义9。实验建立大白兔运动关节软骨损伤模型，分别植入定向支架和非定向支架，探讨定向结构软骨支架材料的制备方法及对大白兔运动关节软骨损伤的修复效果。1 材料和方法 Materials and methods 1.1 设计 随机对照动物实验。1.2 时间及地点 于2014年12月至2016年5月在山西医科大学实验中心完成。1.3 材料 纳入51只大白兔，雄性，体质量(2.60.3) kg，均由山西医科大学动物实验中心提供。实验过程中对大白兔的饲养、处理均符合关于善待实验动物的指导性意见相关规则10-11。其中1只兔用于关节软骨细胞外基质提取，2只兔用于骨髓间充质干细胞制备，其余48只兔按随机数字表法分为非定向支架组和定向支架组(n=24)进行动物分组实验。1.4 方法1.4.1 兔关节软骨细胞外基质提取 无菌条件下用15号手术刀切取1只大白兔关节软骨(图1A)，放入含有青霉素及链霉素双抗的PBS进行3次冲洗，放入超净台中晾干。将晾干的软骨篇移植到20 cm容器中，加入液氮硬化软骨后迅速植入粉碎机中进行粉碎，采集软骨颗粒。将软骨颗粒溶解在双抗的PBS中，采用400目筛网滤过，获得直径150 m的软骨颗粒(图1B)，加入0.25%胰蛋白酶、0.1%EDTA及双抗的PBS，振荡及5 min离心，速度7 000 r/min，PBS 3次冲洗。向软骨颗粒中加入50 U/mL DNase、1 U/mL RaseA和双抗缓冲液，30 min搅拌，重复离心、洗涤3次。将最终收集的细腻沉淀放入PBS中，放在-20 进行24 h冷冻，放入干燥机中冻干，获得白色薄膜(图1C)12。1.4.2 定向支架制备 采用温度梯度热诱导相分离技术制备定向支架材料。采用去离子水配置浓度为2%的软骨基质溶液，搅拌，离心(700 r/min)。将混合软骨细胞外基质溶液注入聚四氟乙烯中，并将放入液氮中静置4 h，构建出由上至下逐渐降温的一维温度梯度场，诱导混合溶液可以顺着温度梯度方向排列，形成柱状晶体；将获得的晶体从液氮中取出，放入冷冻干燥机中进行24 h干燥，从而形成定向孔隙结构的支架(图2A)13-14。1.4.3 非定向支架制备 采用去离子水配置浓度为2%的软骨基质溶液，搅拌后5 min离心，速度为700 r/min，去除溶液中存在的气泡。将混合溶液放置在四氟乙烯中，分别放入-20 、-80 下2 h，干燥24 h获得多孔结构软骨基质支架(图2B)15-16。将0.1 g京尼平粉末混合20 mL去离子水中，搅拌溶解，制备京尼平溶液。利用手术刀将支架切割成圆柱状，浸泡在京尼平溶液中，在37 下交联24 h，待支架变为深蓝色后取出。1.4.4 大白兔骨髓间充质干细胞制备 取2只大白兔，按0.2 mL/kg剂量肌肉注射麻醉药物，大白兔平卧在兔台上，对内侧胫骨进行备皮、消毒，铺巾，利用16号骨穿刺，以预置肝素的注射器吸取2 mL骨髓，梯度离心，采用D-hanks洗涤离心2次，将采集的细胞重新悬浮在含体积分数10%胎牛血清的高糖DMEM培养基中，计数有核细胞后接种在 100 mL培养瓶中，3 d后换全液，以后每两至三天换液1次，待细胞融合80%后进行传代培养。取第3代大白兔骨髓间充质干细胞接种在100 mL培养瓶中，将其放入37 下，体积分数5%CO2的培养箱中，培养21 d后采用胰酶消化采集细胞，调整细胞浓度为11010 L-1，将两种支架切割成直径4 mm、厚度2 mm圆柱状，吸取10 L细胞悬液到支架表面，最终每块支架植入5105个细胞，将支架放入细胞培养箱中进行2-4 h孵育，备用17-18。1.4.5 大白兔运动关节软骨缺损模型建立及处理 取48只大白兔采用3.6%水合氯醛全身麻醉，麻醉生效后完成消毒、铺巾。在无菌操作取双侧膝关节内侧切口入路，利用15号手术刀逐层切开表层皮肤、皮下筋膜和膝关节囊，压迫止血后充分暴露屈膝约80到股骨踝部，采用2 mm钻头磨钻在关节软骨表面造成轻微局部软骨缺损，更换4 mm钻头，扩张形成直径为4 mm、深部为2 mm的运动关节损伤模型，打磨过程中注入生理盐水，并采用庆大霉素冲洗，利用棉签清洗缺损部位。向非定向支架组和定向支架组大白兔损伤运动关节软骨中分别植入定向支架和非定向支架19-20。支架植入完毕后进行逐层缝合关节囊、皮下组织和皮肤切口，手术切口局部注射庆大霉素、碘伏消毒，注射40104 U青霉素，放入笼中常规饲养，见图3。1.5 主要观察指标 软骨支架扫描电镜观察：将支架切割成1 cm1 cm1 cm大小，扫描电镜下观察支架微管结构；支架材料的物理、力学性能测定：a支架密度：将2组支架切割成块状，采用游标卡尺测定其体积，称量支架质量，测定支架密度；b支架孔隙率：采用排液法检测2种软骨支架的孔隙率；c弹性模量测定：采用生物生物材料力学测试机检测支架的抗压缩性能，绘制应力-应变曲线，计算弹性模量21；大白兔骨髓间充质干细胞在支架上的分布及形态：采用电镜观察成软骨诱导骨髓间充质干细胞在定向和非定向软骨支架上的分布情况，并观察细胞形态；关节软骨修复效果显微CT观察：2组大白兔术后6，12，24周采用过量麻醉方法处死大白兔，每个时间段处死8只。取股骨踝部进行显微CT分析，采用ODriscoll量表评分进行修复效果评估，评分的观察项目包括组织形态学、细胞外基质染色、表面平整度、组织完整性、新生软骨厚度、与周围正常软骨结合度、软骨细胞集聚、细胞数量减少、周围正常软骨退化、炎症反应，总分26分，得分越高，修复效果越理想；关节软骨修复效果组织学观察：取关节软骨损伤部位修复后组织，将其放入甲醛溶液中固定，5 m切片，石蜡包埋，苏木精-伊红染色5 min，倒置显微镜下观察苏木精-伊红染色结果22。1.6 统计学分析 采用SPSS 18.0软件处理，计数资料采用百分数表示，行卡方检验；计量资料采用s表示，行t 检验，P 0.05)；定向支架组支架材料弹性模量显著高于非定向支架组(P 0.05)，见表1。2.4 骨髓间充质干细胞形态及在支架上的形态 倒置显微镜下观察原代骨髓间充质干细胞24 h后开始部分贴壁， 3 d后细胞呈圆形，7 d后原代细胞占据培养瓶底大部，细胞为多角形(图5A)。扫描电子显微镜下，骨髓间充质干细胞在定向及非定向软骨支架黏附较好，接种1 d后细胞未铺开，为球状(图5B)。定向支架组可见大量球星细胞黏附在微观侧壁，细胞规则具有方向性和规律性；非定向软骨支架中可见大量球星细胞黏附在微管侧壁，细胞比较随机(图5C、D)。2.5 两组大白兔一般观察 所有大白兔术后均存在跛行现象，切口部位均未出现红肿、化脓等。定向支架组大白图1 兔关节软骨细胞外基质提取Figure 1 Extraction of the rabbit articular cartilage extracellular matrix图注：图A为切取兔关节软骨；B为直径150 m的软骨颗粒；C为白色薄膜。图3 大白兔运动关节软骨定向及非定向支架材料植入Figure 3 Directional and non-directional scaffolds implanted into the white rabbit articular cartilage图注：图A为大白兔运动关节软骨植入定向支架材料；B为大白兔运动关节软骨植入非定向支架材料。图2 定向支架和非定向支架大体观察Figure 2 Gross observation of the directional and non-directional scaffolds图注：图A为定向支架材料；B为非定向支架材料。图4 两组软骨支架扫描电镜观察(标尺为300 m)Figure 4 Scanning electron microscope observation of the two cartilage scaffolds (scale bar=300 m)图注：图A、B为定向支架纵切面和横切面观察；C、D为非定向支架纵切面和横切面观察。图5 骨髓间充质干细胞形态及在支架上的形态Figure 5 Morphology of bone marrow mesenchymal stem cells and its morphology on the scaffold图注：A图为原代骨髓间充质干细胞(100)；B图为接种1 d后定向软骨支架电镜形态(标尺为100 m)；图C、D为定向支架组与非定向支架组电镜形态(标尺为10 m)。ABC图6 两组支架组CT建模比较Figure 6 Comparison of the CT reconstruction between the two groups图注：图A，B为定向支架组；C，D为非定向支架组。D兔术后3 d恢复较好，活跃程度适中，未发生截瘫、狂躁等不良反应；非定向支架组2只大白兔术后出现腹泻。2.6 两组大白兔术后显微CT下ODriscoll量表评分比较 定向支架组大白兔术后6，12，24周显微CT下ODriscoll量表评分均显著高于非定向支架组(P 0.05)，见表2。术后24周定向支架组大白兔CT下三维重建可见缺损部位平坦、光滑，新生组织与周围正常软骨界限消失；冠状面二维扫面可见新生类软骨厚度与周围正常骨十分接近。非定向组大白兔3D下显示软骨表面比较平整，难以确定原位存在缺损；冠状面2D显示修复软骨与正常软骨基本相同，见图6。2.7 两组大白兔修复关节软骨组织学观察 定向支架组术后6周苏木精-伊红染色可见软骨缺损部位填充大量类软215ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAHAB组别术后6周术后12周术后24周定向支架组12.22.3a16.93.4a19.53.7a非定向支架组1.811.92.5表注：与非定向支架组相比，aP 0.05。表2 两组大白兔术后显微CT下ODriscoll量表评分比较(s，n=24)Table 2 Comparison of the postoperative ODriscoll histological scores of the rabbits in the two groups under micro-CT 组别支架密度(%)支架孔隙率(%)弹性模量(kPa)定向支架组91.63.1105.220.389.357.96a非定向支架组92.23.0114.37表注：与非定向支架组相比，aP 0.05)；定向支架组支架材料弹性模量显著高于非定向支架组(P 0.05)。出现这种现象的原因也是多方面的，由于制备2种支架材料来源、成分分配比完全相同，并且制备的原理也相同，导致2种材料的物理性能十分接近。但是，定性软骨支架具备更好的机械强度，导致材料压缩模量较高。由于定向材料方向相同使得材料具备较高的支撑作用，具备良好的机械力学性能24。成熟关节软骨由于缺乏神经、血管及淋巴组织结构，更多的依赖于关节滑液提供营养，当关节软骨发生损伤后将无法自我修复，容易引起损伤出现积累，引起关节形态、结构发生严重的破坏，增加患者痛苦，影响患者生活质量。目前，临床上对于运动关节软骨损伤主要采用药物治疗、物理治疗及手术治疗为主，这些方法虽然能减轻患者疼痛，改善患者代偿关节软骨功能，但是长期疗效欠佳，预后较差25。本实验中提取大白兔骨髓间充质干细胞进行体外扩增培养，并将其接种在定向支架和非定向支架上并且植入大白兔运动关节损伤软骨中，并取得满意的效果。本实验中定向支架组大白兔术后6周、12周及24周显微CT下ODriscoll量表评分显著高于非定向支架组(P 0.05)。Micro-CT是动物关节软骨损伤修复中常用的方法，该方法能对标本进行3D重建，了解软骨损伤部位的立体结构及内部结构，并且能测量损伤部位的骨密度、骨小梁宽度，对修复效果作出客观的评估，从而能观察关节软骨缺损修复效果。本文中定向支架组术后6周苏木精-伊红染色可见软骨缺损部位填充大量类软骨样组织；术后12周缺损部位存在大量类软骨样组织，可见经典软骨陷窝，细胞排列呈垂直方法；术后24周缺损部位消失，软骨细胞呈垂直方向排列，与正常组织几乎相同。非定向支架组术后6周苏木精-伊红染色可见缺损局部存在大量类软骨样组织；术后12周软骨缺损部位存在大量类软骨样组织充填；术后24周缺损部位存在典型软骨陷窝，与周围软骨组织存在差异。定向结构软骨支架结构植入缺损关节后，定向结构软骨支架能诱导细胞沿着特定的方向排列的微管垂直分布，并且随着支架的不断降解，支架内的细胞会不断完成填充，最终形成新的软骨，能更加有效的抵抗关节受到的压力，具备更加优秀的力学性能，从而促进缺损部位早期恢复26。综上所述，基于大白兔软骨细胞外基质材料采用温度梯度热诱导相分离技术能获得定向微管结构的软骨支架，具备良好的物理、力学性能。将定向结构软骨支架植入大白兔运动关节损伤软骨中能促进损伤部位修复，获得理想的机械力学性能。致谢：感谢山西医科大学的郭秋林老师的大力支持以及提供实验场地。作者贡献：赵霞负者实验设计，郭秋林负者实验实施。利益冲突：所有作者共同认可文章内容不涉及相关利益冲突。伦理问题：实验过程中对动物的处置符合2009年Ethical issues in animal experimentation相关动物伦理学标准的条例。实验方案中有关动物伦理问题已经山西医科大学实验动物伦理委员会讨论批准。文章查重：文章出版前已经过CNKI反剽窃文献检测系统进行3次查重。文章外审：文章经国内小同行外审专家双盲外审，符合本刊发稿宗旨。作者声明：第一作者赵霞对于研究和撰写的论文中出现的不端行为承担责任。论文中涉及的原始图片、数据(包括计算机数据库)记录及样本已按照有关规定保存、分享和销毁，可接受核查。文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。开放获取声明：这是一篇开放获取文章，文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。根据知识共享许可协议“署名-非商业性使用-相同方式共享3.0”条款，在合理引用的情况下，允许他人以非商业性目的基于原文内容编辑、调整和扩展，同时允许任何用户阅读、下载、拷贝、传递、打印、检索、超级链接该文献，并为之建立索引，用作软件的输入数据或其它任何合法用途。4 参考文献 References1 Vo N,Niedernhofer LJ,Nasto LA,et al.An overview of underlying causes and animal models for the study of age-related degenerative disorders of the spine and synovial joints.J Orthop Res.2013;31(6):831-837. 2 Capeci CM,Turchiano M,Strauss EJ,et al.Osteochondral allografts: applications in treating articular cartilage defects in the knee. 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