高效液相色谱法测定甜菜糖蜜中的葡萄糖蔗糖和棉籽糖

高效液相色谱法测定甜菜糖蜜中的葡萄糖 、蔗糖和棉籽糖莺 3董爱军 ,张英春 ,杨鑫 ,张华 ,马(哈尔滨工业大学食品科学与工程学院 ,黑龙江哈尔滨 150090 )摘 要 :建立了同时测定甜菜糖蜜中葡萄糖 、蔗糖和棉籽糖的分析方法 ,即样品采用 C18 固相小柱脱色净化 ,正相色谱分析测定 。色谱条件 :色谱柱为 A gilen t Zo rbax ca rbohyd ra te柱 ( 416 250mm , 5m ) ,流动相为乙腈 -水 ( 80 20, V V ) ,流速1mL /m in,柱温 35, R ID 检测 。实验结果表明 :葡萄糖在 110mg /mL、蔗糖在 10100m g /mL、棉籽糖在 15m g /mL 范围 内线性良好 ,相关系数分别为 019999、019999、019994; 3 种糖的相对标准偏差 ( R SD )分别为 5179%、0131%、3131% ( n = 5 ) , 平均回收率分别为 9813%、9716%、10117%。该分析方法简便 、准确 、灵敏 ,重现性好 ,适用于糖蜜中糖类的检测 。关键词 :高效液相色谱 ,甜菜糖蜜 ,葡萄糖 ,蔗糖 ,棉籽糖D e ter m ina t ion of g luco se , sucro se an d ra ff in o se inbee t m o la sse s by h igh perfor m an ce l iqu id chrom a togra phy3DO NG A i- jun, ZHA NG Y in g- chun, Y A NG X in, ZHA NG Hua, M A Y in g( Food Sc ience and Enginee ring Co llege of H a rb in In stitu te of Techno logy, H a rb in 150090 , Ch ina)A b s tra c t: A m e th o d w a s d e ve lop e d fo r th e d e te rm in a tio n o f g lu c o s e , s u c ro s e a n d ra ffio n s e in b e e t m o la s s e s b y h ig hp e rfo rm a n c e liq u id c h rom a to g ra p h y1Th e s am p le w a s p u rifie d w ith C18 s o lid p h a s e c o lum n, th e n w a s s e p a ra te d o n aZo rb a x c a rb o h yd ra te c o lum n ( 416m m 250, 5m ) a t 35, w h ic h w a s th e n e lu te d w ith 80% a c e to n itrile a q u e o u s s o lu tio n a t a ra te o f 1m L /m in, a n d th e s ig n a l w a s d e te c te d b y R ID 1Th e re s u lts s h ow e d th a t th e lin e a r ra n g e fo r g lu c o s e , s u c ro s e a n d ra ffin o s e , re s p e c tive ly w e re in th e ra n g e o f 110m g /m L, 10100m g /m L a n d 15m g /m L w ith ac o rre la tio n c o e ffic ie n t o f 0199940199991Th e re la tive s ta n d a rd d e v ia tio n s fo r g lu c o s e , s u c ro s e a n d ra ffin o s e w e re5179% , 0131% a n d 3131% re s p e c tive ly ( n = 5) a n d th e a ve ra g e re c o ve rie s w e re 9813% , 9716% a n d 10117% re s p e c tive ly1Ke y w o rd s: h ig h p e rfo rm a n c e liq u id c h rom a to g ra p h y; b e e t m o la s s e s; g lu c o s e; s u c ro s e; ra ffin o s e中图分类号 : TS20713文献标识码 : A文 章 编 号 : 1002 - 0306 ( 2008 ) 012 - 0245 - 03甜菜糖 蜜是 甜 菜制 糖工 业 的一 种副 产 物 , 呈棕褐色 ,黏稠状 ,其总糖含量可达 50 %60 % ,同时亦含 有大量的有机或无机物质 , 是发酵 、食品 、饲料和建 材工业中质优价廉的原料 1 。糖蜜中的糖类主要包括单糖双糖和三糖 , 如葡萄糖 、果糖 、蔗 糖 、棉籽 糖 、 蔗果三 糖 等 , 其 中 棉 籽 糖 , 又 名 棉 实 糖 、蜜 三 糖 、桉 糖 ,是一种由 微 生物 和 酶不 能合 成 的功 能性 低 聚糖萄糖 、蔗糖 和 棉 籽 糖 的 含 量 , 并 对 实 际 样 品 进 行 了分析 。1材料与方法1 11 材料与仪器葡萄糖 、蔗 糖 和 棉 籽 糖 标 准 品购 自 Sigm a 公司 ;乙腈 为色谱纯 , 购自山东禹王实业有限公 司 ;甜菜糖蜜 包头华资实业股份有限公司 。A gilen t 1100型高效液相色谱仪 配备四元梯度 泵 ( G1311A ) 、100 位自动进样器 ( G1313A ) 、示差折光检测 器 ( G13162A R ID ) 、柱 温 箱 ( G1316A ) 、A gilen tZo rbax ca rbohyd ra te柱 ( 416 250mm , 5m ) ; 固相萃取 2 , 3 低聚糖 ,具有使双歧杆菌增殖和改善排便等功能,广泛存在于甜菜 、棉籽 、桉树叶 、蜂蜜 、卷心菜 、酵母 、 马铃薯 、葡萄 、麦类和豆科植物的种籽中 , 目前主要 从棉籽粕和甜菜糖蜜中提取 。准确测定甜菜糖蜜中 糖的组成和含量对于糖蜜的开发利用有很重要的意 义 。糖类的测定通常采用容量法 、比色法 、旋光法和 气相色谱法 4 , 5 。近年来用液相色谱法测定糖类的组 成和 含 量 得 到 了 快 速 发 展 , 特 别 是 低 聚 糖 的 测 定 6 10 。但目前国内外还未见报道用 H PLC 方法同时测定糖 蜜中 葡 萄糖 、蔗 糖 和棉 籽糖 。本文 采 用 固 相萃取 - 高效液相色谱法同时测定甜菜糖蜜中的葡柱SU PELCL EAN ENV I - 18; 化 学 工 作 站H PChem sta tion system; m illipo re p u rifica tion system 超 纯 水系统 。1 12 色谱条件色 谱 柱 : A gilen t Zo rbax ca rbohyd ra te 柱 ( 416 250mm , i 1d 15m ) ;流动相为乙腈 - 水 ( 80 20 , V V ) ;流速 1mL /m in; 柱 温 35 ; R ID 检 测 器 , 检 测 池 温 度35 ;进样量 10L。1 13 标准溶液配制准确称取一 定 量的 葡萄 糖 、蔗 糖 和 棉 籽 糖 标 准收稿日期 : 2008 - 04 - 18 3 通讯联系人作者简介 :董爱军 ( 1969 - ) ,女 ,副教授 ,研究方向 :食品安全检测 。2008 年第 12 期245食品工业科技Sc ience and Techno logy of Food Indu stry分析检测品 ,分别用去离子水溶解并准确定容 ,配制成葡萄糖和棉籽糖浓度为 100m g /mL、蔗糖浓度为 1000m g /mL的标准储备液 。准确吸取储备液混合 、稀释 ,配制成葡萄糖浓度 为 1、2、4、8、10m g /mL , 蔗 糖 浓 度 为 10、20、40、80、100m g /mL ,棉籽糖浓度为 1、2、3、4、5m g /mL 的系列 混合标准溶液 。各浓度标准溶液用封口膜密封后置 冰箱中 ,使用前放置至室温 。1 14 样品处理准确 称 取 5100 g 甜 菜 糖 蜜 , 用 去 离 子 水 定 容 至50mL ,备用 。 C18 固相萃取小柱先用 2mL 甲醇活化 , 再用 2mL 水洗去甲醇 ,取 1015mL 稀释样品通过小 柱 ,弃去最初的 3mL 滤液 ,收集后续的 3mL 滤液 ,用0145m 滤膜过滤 ,待测 。1 15 定量方法取各浓度混合标准溶液 ,进样量 10L ,以峰面积一浓度绘制工作曲线 。将处理后的样品溶液进行液 相色谱分析 , 以保留时间定性 , 外标法定量 , 测定糖 蜜中葡萄糖 、蔗糖和棉籽糖的含量 。2 结果与分析2 11 样品前处理方法的选择除糖类以外 ,甜菜糖蜜还含有色素 、含氮化合物和钾 、钙 、钠 、镁等无机离子 ,糖蜜中的色素包括多酚 类植物色素和生 产 过程 中产 生 的色 素 , 如还 原 糖分 解物 、还原糖与氨基酸作用生成的拟黑色素 、蔗糖焦 化形成的 焦糖 色 素等 。含氮 化 合物 包 括蛋 白质 、氨 基酸和酰胺等 , 这些 物 质的 存在 一 是影 响糖 类 的分 离 ,二是色素类物质容易污染色谱柱 ,使色谱柱的分离度和寿命 降 低 。本 实 验 选 用 两 种 前 处 理 样 品 方 法 ,硝酸铅絮凝脱色法和 C18固相萃取小柱净化法 ,实 验表明 , 硝酸铅脱色法虽然操作简单 , 脱色率较 高 , 但只脱除色素等 大 分子 物质 , 并 且 引进 了有 污 染的 铅离子 。经 C18固相萃取小柱净化的样品 ,脱色率高 , 能去除大部分色素和一些非极性的物质 。本方法采 用固相萃取前处理样品 。2 12 流动相的选择本实验以乙腈 - 水为流动相 ,通过改变乙睛与水的比例优 化 色 谱 条 件 。以 乙 腈 - 水 分 别 为 85 15、80 20、75 25 (V V )测定了混合标准溶液和糖蜜中葡 萄糖 、蔗糖和棉籽糖含量和分离情况 。实验表明 ,随 着已腈浓度的增加 ,糖蜜中的糖分离程度提高 ,当流 动相中已腈和水的比例为 85 15 时分离效果最佳 ,但 是分离时间 较 长 。当 流 动 相 中 已 腈 和 水 的 比 例 为75 25时分离效果不好 ,葡萄糖和相邻峰的分离度较 差 。当流动相中已腈和水的比例为 80 20 时分离效果很好 ,且保留时间较理想 。综合考虑各个因素 ,本 实验采用流动相的比例为 80 20 ,标准品和样品色谱 图见图 1。2 13 标准曲线和检出限以 113 中配制的 5 个浓度水平的混合标准溶液 , 进行液相色谱分析 ,进样量为 10L ,以峰面积为纵坐 标 ( y) , 标准 溶液 浓 度 ( m g /mL ) 为横 坐标 ( x) , 作校 正曲线并进行线性回归 。以 3 倍信噪比 ( S /N ) 为检 出 限 ( LOD ) , 葡 萄 糖 为 0121m g /mL , 蔗 糖 为0144m g /mL ,棉籽糖为 0123m g /mL ,回归方程见表 1。图 1标准物质色谱图 (A )与糖蜜样品色谱图 (B )11葡萄糖 ; 21蔗糖 ; 31棉籽糖表 1 回归方程和相关系数线性范围(m g /mL )成分回归方程相关系数y = 7732215567 x + 385120089 y = 9295310798x- 561516044y = 8702012743 x + 310511019019999019999019994葡萄糖蔗糖棉籽糖11010100152 14精密度实验取同一甜菜糖蜜样品 , 按照114 进行 处 理 , 重复进样 5 次 , 进 行 精 密 度 实 验 , 记 录 峰 面 积 , 3 种 糖 的R SD = 0131 %5179 % ( n = 5 ) ,结果见表 2。2 15 回收率实验精密称取 5 g已知含量的糖蜜 9 份 , 每 3 份为 1组 ,分别加入高 、中 、低 3 个浓度水平的标准储备液 , 按 114 样品前处理方法进行处理 ,分别进样 10L ,由 回归方程计算回收率和相对标准偏差 ( R SD ) 。葡萄 糖 、蔗 糖 、棉 籽 糖 的 平 均 回 收 率 分 别 为 9813 % 、9716 % 、10117 % , R SD = 0167 %4162 % ,结果见表 3。2 16实际样品测定取三个批次的糖蜜样品 ,按 114 样品前处理方法处理样品 ,进样 10L , 按 112 的色 谱 条件 进 样分 析 ,用外标法定量 ,结果见表 4。表 4糖蜜样品测定结果样品葡萄糖 ( % )蔗糖 ( % )棉籽糖 ( % )1 #2 #3 #116911234116541190361652162317811693 结论本实验建立了固相萃取 - 高效液 相 色谱 同 时测定甜菜糖蜜中的葡萄糖 、蔗糖和棉籽糖含量的方法 , 结果表明 ,该方法样品前处理简单 、操作方便 、准确 、 可靠 ,适用于糖蜜中糖类的检测 。参考文献 : 1 张捷 ,董爱军 1糖蜜的资源化利用 (上 ) J 1中国甜菜糖 业 , 2007 ( 2 ) : 38401 2 杨寿清 1 天然功能性活性因子 棉籽糖 J 1 冷饮与 速冻食品工业 , 2002 , 8 ( 3) : 42441 3 董爱军 ,张捷 1甜菜中的功能性低聚糖 棉实糖 J 12462008 年第 12 期分析检测Vo l. 29 , No. 12 , 2008食品工业科技表 2 方法的精密度实验结果 ( n = 5 )R SD ( % )成分峰面积峰面积平均值葡萄糖蔗糖棉籽糖527068442152221387353872844514152039005753634422486204353572067442928919495150066944156142067625427794428065204768517901313131表 3添加回收率实验结果 ( n = 3)原含量 (m g)添加量 (m g)检出量 (m g)回收率 ( % )平均回收率 ( % )R SD ( % )成分1002003001000150020002050148102531534615337115384515432415146101851096101001898129816971397101001011810521098131181葡萄糖蔗糖23851597160167棉籽糖12610101174162 100 21310 8710 中国甜菜糖业 , 2001 ( 3 ) : 24261 4 大连轻工业学院等八大院校 1 食品分析 M 1 北京 : 高 等教育出版社 , 199411541891 5 Apo sto lo s I Ka rou tis, Robe rt T Tyle r, Geo rge P Sla te r1A na lysis of legum e o ligo saccha ride s by h igh - re so lu tion ga sch rom a tograp hy J 1Jou rna l of Ch rom a tograp hy A , 1992 , 623 ( 1) : 1861901 7 袁美兰 ,温辉梁 ,章志明 1棉籽饼粕中棉籽糖的 H PLC法测定 J 1中国食品添加剂 , 2003 ( 1) : 86891 8 朱建华 ,杨晓泉 1反相液相色谱法同时测定大豆制品中 的功能性低聚糖 水苏糖和棉籽糖 J 1 粮油加工与食品 机械 , 2005 ( 11) : 75761 9 I R Kennedy, O D Mwandem e le, K S M cW h irte r1 E stim a tion of suc ro se, raffino se and stachyo se in soybean seed s J 1Food Chem istry, 1985 , 17 ( 2 ) : 85931 10 G V acca ri, G Lod i, E Tam bu rin i, T B e rna rd i, S To si1D e tec tion of o ligo saccha ride s in suga r p roduc ts u sing p lana rch rom a tograp hy J 1Food Chem istry, 2001 , 74 ( 1 ) : 991101 6 C ristina M a rtnez - V illa luenga, J uanaF ra s, Concep c inV ida l - V a lve rde1R affino se fam ily o ligo saccha ride s and suc ro se con ten ts in 13 Sp an ish lup in cu ltiva rs J 1Food Chem istry, 2005 ,91 ( 4) : 6456491(上接第 242 页 )行了检测 。测定结果如表 围之内 。 1 M afia G A , M agda M , Fab iana S1Bovine lac tofe rrin p reven ts the entry and in te rce lluL a r sp read of he rp e ssimp lex viru s type l inGreen Monkey Kidney ce lls J 1A n tiviral R e s, 2007, 76: 2522621 2 Giovanna L , V a le ria P, Mon ica M , e t a11L ac tofe rrin inh ib its ea rly step s of hum an B K po lyom aviru s infec tion l J 1A n tivira l R e s, 2006, 72: 1451521 3 Strom M B , H ang B E, R ekd M Q , e t a11 Impo rtan t struc tu ra l fea tu re s of 15一 re sidue lae tofe rric in de riva tive s and m e thod s fo r imp rovem en ts of an tim ic rob ia l ac tivity J 1B iochem , 2002, 80:65741 5 Voge l H J , Seh lb li D J , J ing W , e t a11Towa rd s a struc tu re func tion ana lysis of bovine lac tofe rric in and re la ted tryp top han - and a rgin inecon ta in ing p ep tide s J 1B iochem , 2002, 80: 49631 6 J e sson H , A nde rsen J H , U h lin - H an son L , e t a11A n ti- H SV ac tivity of lac tofe rric in ana logue s is on ly p a rtly re la ted to the ir affin ity fo r hep a ran suL fa te J 1A n tivira l R e sea rch, 2004 ( 61 ) :1011091 7 M A M an so, M M igue l1 App lica tion of cap illa ry zone e lec trop ho re sis to the cha rac te riza tion of the hum an m ilk p ro te in p rofile and its evo lu tion th rougho