创伤弧菌检测方法.doc

申报近海水域创伤弧菌检出率调查的检测方法确定1.概述创伤弧菌是一种可能致命的病原菌，深入了解水体、海产品等各种环境中创伤弧菌的生态学，将有助于降低消费者感染创伤弧菌的风险。目前创伤弧菌检测方法主要有传统分离鉴定方法、免疫学及基因检测方法1，介于当前本中心的实验条件，适宜采用传统分离鉴定方法。以下对该方法进行表述。2.传统分离鉴定方法2.1仪器与试剂2.1.1创伤弧菌标准菌株创伤弧菌属于危害程度第三类病原微生物2，本实验室已配备生物安全柜，具有BSL-2实验室水平，满足第三类病原微生物的操作要求。在准备阶段，需购买创伤弧菌标准菌株（ATCC 27562）进行方法确认。2.1.2选择性培养基选择性原理：以纤维二糖为碳源，创伤弧菌利用纤维二糖后产生黄色菌落，便于与其他菌落区分。添加了抗生素，所添加的抗生素对创伤弧菌的抑制作用较小，而对其他大多数细菌的生长具有较强的抑制作用。培养温度高，在较高温度条件下，创伤弧菌能正常生长，而其他大多数细菌在这个温度下生长受到抑制或根本就不能存活。在环境分离中分离创伤弧菌时，最好是先用CC琼脂培养基、VVM培养基或VVMc培养基进行培养，在获得创伤弧菌菌株后，再用CPC琼脂培养基或mCPC琼脂培养基进行纯化，这样可以再较短的时间内获得创伤弧菌纯化菌株3。此外在海产品检测中，用TCBS进行分离也是一种有效的常规方法。2.2检测方法2.2.1样品采集拟与宁海县海洋渔业局合作，对近海水产品和海水按区域进行样品采集，其中近海水产品主要为贝壳类养殖水产品。海水采集按季节（气候条件）分区域按海洋环境监测规范操作；海产品根据海水采集点分别就近采集，以获取其关联性信息。计划采集样品200份。2.2.2分离鉴定2.2.2.1 海水样品水样处理：采集的海水样品摇匀后量取100mL，加入无菌Tween 80至终浓度为510-6g/mL，振荡2030min成悬浮液，用无菌生理盐水按10倍浓度梯度系列振荡稀释4。分离鉴定：采用选择性培养基进行平板涂布，选择3个连续的适宜稀释度，每个稀释度涂布2个平板，于36进行培养2-5d。对平板上生长的可疑菌落进行生化鉴定。2.2.2.2 海产品海产品处理：称取5g可食部分样品加入200mL碱性蛋白胨进行无菌均质，置于30培养1824小时。取培养物进行10倍梯度稀释，选择3个连续的适宜稀释度划线选择性平板，每个稀释度涂布2个平板，于36进行培养2-5d。对平板上生长的可疑菌落进行生化鉴定。2.2.3 分析方法2.2.3.1 按检测时间整理数据，分析创伤弧菌检出率与季节（气候、温度等条件）的关系。2.2.3.2 按抽样地点整理数据，分析创伤弧菌检出率与地理环境的关系。2.2.3.3 比对同一区域内，海水创伤弧菌检出率与海产品创伤弧菌检出率的关系。参考文献1 陈艳，付萍.创伤弧菌检测方法的研究进展J.国外医学卫生学分册，2008,35(2):91-96.2 中华人民共和国卫生部. 人间传染的病原微生物名录. 中华人民共和国卫生部制定, 二六年一月十一日.3 张新中，文万侥，徐先栋，等.创伤弧菌(Vibrio vulnificus)五种选择性培养基的比较分析J.现代渔业信息,2007,22(10