《PCR检测技术》PPT课件

PCR检测技术,一、PCR的定义,PCR聚合酶链式反应，又称休外DNA扩增技术。近年来发展起来的一种体外扩增特异DNA片段的技术。,二、PCR技术的基本原理,1、PCR原理用于扩增位于两段已知序列之间的DNA片段，类似于天然DNA的复制过程。以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板5末端和3末端互补的寡苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成，重复这一过程，即可目的DNA片段得到扩增,半保留复制,2、三个基本的步骤循环变性加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两条单链。退火突然降温后模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，也存在两条模板链之间的结合，但由于引物的高浓度，结构简单的特点，主要的结合发生在模板与引物之间。延伸将反应温度调节到酶的最适温度，在DNA聚会酶等作用下，重新结合形成与模板互补的新DNA链。,上述3步为一个循环，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过2540个循环后DNA可扩增106109倍。,变性,延伸,退火,三、PCR的基本操作,反应体系的配制,标本的制备,反应条件的选择与优化,扩增产物的分析,PCR技术路线/流程,PCR实验室,505试剂配制室；506标本处理室；507扩增室；508扩增产物分析室。,505PCR配制室,该实验区主要进行的操作为贮存试剂的制备、试剂的分装和主反应混合液的制备。试剂和用于标本制作的材料应直接运送至该区，不得经过其他区域。,506标本处理室,主要进行的操作为临床标本的保存、核酸(RNA、DNA)提取、贮存及其加入至扩增反应管和测定RNA时cDNA的合成。,1、在本区的实验操作，必须戴手套并经常更换。2、为避免样本间的交叉污染，加入待测核酸后，必须盖好含反应混合液的反应管。3、对具有潜在传染危险性的材料，必须有明确的样本处理和灭活程序。4、样本处理对核酸扩增有很大影响，必须使用有效的核酸提取方法。,核酸提取方法,离心柱法全自动核酸提取仪采用离心机和自动移液装置想结合的方法,1、离心柱法,2、磁珠法,607PCR扩增室,该区域主要进行的操作为DNA或cDNA扩增及实时荧光PCR仪的结果判读。此外，已制备的DNA模板和合成的cDNA(来自样本制备区)的加入和主反应混合液(来自试剂贮存和制备区)制备成反应混合液等也可在本区内进行。,1、不能从本区再进入任何“上游”区域，可降低本区的气压以避免气溶胶从本区漏出。2、为避免气溶胶所致的污染，尽量减少走动。,PCR仪,508PCR扩增产物分析室,主要进行的操作为扩增片段的测定。,1、最主要的扩增产物污染来源，因此必须注意避免通过本区的物品及工作服将扩增产物带出。2、本区有可能会用到某些可致基因突变和有毒物质如溴化乙锭、丙稀酰胺、甲醛或同位素等，应注意实验人员的安全防护。3、本区如采用负压或减压情况下可减少扩增产物从本区扩散至前面区域的可能性。,四、实时荧光PCR技术,在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。,三个基本概念,1、扩增曲线2、荧光阈值3、Ct值,扩增曲线图：横坐标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光强度每个循环进行一次荧光信号的收集,PCR污染与对策,污染原因,1、PCR扩增产物污染最主要最常见的污染问题。2、标本间交叉污染主要由于盛装标本的容器被污染、加样枪污染导致标本间污染、有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶扩散，导致彼此间的