高通量测序样本.ppt

高通量测序样本制备,葛芹玉geqinyu,高通量测序样本准备的重要性,各种不同类型的样本基因组DNA（resequencing）宏基因组测序（也称微生物环境基因组，或元基因组）cDNAmRNAmiRNAMethylationChIP-chipExon，Chrometc代表性问题：原始样本的完整性与量的问题、各种偏性、误差、各种可能的污染等等。,测序样本制备的基本流程,样本核酸的获取（血液，组织，细胞，血清，）测序文库制备DNA文库mRNA文库miRNA文库片段选择文库编码文库barcode测序模板制备乳液PCR桥式PCR滚环扩增步骤繁琐,第一节测序文库制备,样本核酸（DNA/cDNA）的质控标准DNA:完整性TotalRNA:完整性（Agilent）miRNAPretreatment某测序公司原始样本需求1.所需TotalRNA的量均不少于20g/文库，TotalRNA可以保存在DEPC处理过的水中、75%的乙醇、异丙醇中，具体以什么方式保存请注明。2.如提供实验材料为动物组织材料，样品质量需大于2g；3.如提供实验材料为植物样品，样品质量需大于4g；4.如提供实验材料为培养细胞，请提供1107培养好的细胞；5.如提供实验材料为血液样品，请提供2ml的样品。,一、样本DNA等的片段化技术1、超声破碎技术,能量水平，时间，体积等参数,不足之处：体积大易污染精度不够,CovarisS-series,2010年1月5日报道安捷伦科技公司(NYSE:A)与Covaris公司于今日宣布了签订一项合作开发市场协议，该协议表明，未来CovarisS2DNA剪切技术将与安捷伦SureSelect靶向序列捕获系统一起销售，以提高新一代测序实验的效率。,CovarisAdaptiveFocusedAcoustics(AFA),浓度不同,长度不同,物种不同,一些比较理想的结果,体会：有很大的损失不同的样本需要不同的优化，没有现成可直接用的条件,2、片段化酶,最初是利用限制性内切酶（Endodeoxyribonuclease）或DNA酶I（DeoxyribonucleaseI）配合Mn2+将DNA大片段切割成小片段针对新一代的高通量测序平台，已经有多家公司开发了配套的酶切试剂，多数是利用几种酶组合而成，其中包含一种可以在双链DNA上有随机识别位点的酶将双链DNA制造切口，然后由另外一种酶将切口处的单链DNA切断形成双链DNA片段Fragmentase：该片段化酶产品包含着两种不同功能的酶，其一可以实现在DNA双链分子上随机制造切口（nick），另一种酶可以识别这种切口并且在互补链对应处制造缺口，从而完全从该处断开双链DNA，从而实现只需根据反应时间的长短获得不同长度的DNA片段，范围为100800bpDNA。不同的处理反应时间获得的长度有所差异，但是这种处理方法对原始样品的需求较大，而且对于目前主流的二代测序技术而言，还需要进一步切胶选择特定的片段，而且该商品对于不同样品的反应效果均一性有待进一步验证,Fragmentase（NEB）,GeneratesdsDNAbreaksinatime-dependentmannertoyield100800bpDNAfragmentsdependingonreactiontime.,损失相对较小集中程度不高，需要后续的片段选择,3、HydroShear,TheHydroshearisusedforfragmentingDNAtosizeslargerthan1KB.TheHydroShearoffersthesimplest,mostreproducible,andmostcontrollablemethodavailableforgeneratingrandomDNAfragments.VirtuallyanysourceofDNAatanyconcentrationinvolumesassmallas40lcanberandomlyfracturedtowithinatwo-foldsizedistribution.Forinstance,ifyourtargetsizeis2kb,youcancalibratetheHydroSheartoproduceadistributioncenteredon2kbwith90%ofyourDNAfallingbetween1.3kband2.6kb,HydroShear,HydroShear,我们的结果,可以实现自动清洗的新设备,4、雾化法（Nebulization）,DNA雾化仪的工作原理如下：高压氮气从顶端压入，通过两侧的进气道对底部的DNA缓冲液混合物产生压力，液体顺着中部细管上升至顶部。顶部出液口处有筛子之类的东西，DNA通过“筛子”，被打成小片段。通过调节压力大小，可以把DNA打成所需要的bp长度。在使用之前DNA必须经过纯化。,雾化法DNA片段化,通常采用的DNA溶液体系为：1g-g经纯化的基因组DNA溶解于50L的TE，并加入700Lnebulizationbuffer。对DNA进行雾化分钟，气体压力为32-35psi（Poundspersquareinch。P是磅pound，S是平方square，I是英寸inch），雾化环境为冰浴。所得的典型结果为DNA打碎至01200bp，峰值为5600bp雾化法与更早期的酶切法相比，可重复性相对较好，并且对于所处理的DNA序列没有选择性，非常快速并且便宜。但是所得的DNA分子片段长度的区间非常大，使得处于可用区间20020bp的片段仅占10%左右。为了满足新一代测序的要求，必须要选择长度较为集中的片段，增加的纯化筛选造成了样本DNA的大量流失。这一缺点不仅使成本增加，而且使得痕量DNA的研究难以实现，因而商业推广价值较小。通量较低也是其显著缺点。目前已经基本被CovarisTM超声仪进行超声打碎替代。,片段化方法比较,数字表达谱,二、FragmentRecovery（Sizeselection）,1、传统切胶回收操作复杂专门试剂盒效率低高效试剂盒开发？,2、改进型的凝胶回收(E-gel),7分钟内完成DNA分离（50bp-10kb）选择琼脂糖浓度为0.8%、1.2%或2%且结合有SYBRSafe或溴化乙啶DNA染料的E-Gel无需紫外线即可实时显示DNA迁移，灵敏度超高快捷简单的DNA条带提取适合低、中、高不同通量,3、新的仪器设备,Caliper的LabchipXT全自动DNA片段回收仪等前期投入大耗材昂贵回收载量低,4、新的试剂bead-basedsizeselection,磁珠法纯化试剂：可以进行某特定片段区域的选择E-Z96Mag-BindOligonucleotidePurificationKitAgencourtBioscienceAMPureBeadsAMPureXPBeadsNEBnextgenerationseries,AgencourtAMPureXPBeads,SPRIworksFragmentLibrarySystem,BeckmanCoulterhascreatedasimplifiedautomatedworkflowthatutilizesSolidPhaseReversibleImmobilization(SPRI)paramagneticbeadbasedtechnologytocreateanautomatedsystemforfragmentlibrarypreparationfortheIlluminaGenomeAnalyzer.,三、End-repair,T4DNAPolymerase（3-5外切）E.coliDNAPolymeraseI(Large(Klenow)Fragment)（5-3聚合）T4PolynucleotideKinase（5磷酸化）,四、通用接头连接,平末端连接粘性末端连接接头自连接问题？,Forkedadaptor（illumina）,Singlereadsadaptor,Pair-endadaptor,DNA连接酶的作用机制,细菌的DNA连接酶以NAD为能源，动物细胞和噬菌体的连接酶以ATP为能源。T4的DNA连接酶可以连接平末端。,尼克酰胺单磷酸,腺苷基,连接酶,DNA连接酶RNA连接酶,五、各种类型测序文库的构建,FragmentPair-endMate-pairDNA/mRNA/miRNAChIP-Seq/MeDIP-Seq/转录组/表达谱等等,PCRAmplification,1、FragmentLibrary/single-readLibrary,单端测序(Single-read)首先将DNA样本进行片段化处理形成200-500bp的片段，测序引物序列连接到DNA片段的一端，然后末端加上接头，将片段固定在flowcell上生成DNA簇，上机测序单端读取序列。,2、Paired-endlibrary,Paired-end方法是指在构建待测DNA文库时在两端的接头上都加上测序引物结合位点，在第一轮测序完成后，去除第一轮测序的模板链，用对读测序模块(Paired-EndModule)引导互补链在原位置再生和扩增，以达到第二轮测序所用的模板量，进行第二轮互补链的合成测序(图2)。,Mate-pair文库制备旨在生成一些短的DNA片段，这些片段包含基因组中较大跨度(2-10kb)片段两端的序列，更具体地说：首先将基因组DNA随机打断到特定大小（2-10kb范围可选）；然后经末端修复，生物素标记和环化等实验步骤后，再把环化后的DNA分子打断成400-600bp的片段并通过带有链亲和霉素的磁珠把那些带有生物素标记的片段捕获。这些捕获的片段再经末端修饰和加上特定接头后建成mate-pair文库，然后上机测序。,3、Mate-pairLibrary,Mate-pairLibrary（ABI）,短序列测序中需要考虑拼接的问题,4、编码文库:barcode/Index,编码文库的必要性两端编码,Indexing(illumina),5、SmallRNAlibrary,问题解决办法,SOLiD,illumina,改进的miRNA测序文库制备,6、TargetCaptureSequencing/Selectionlibrary,MolecularInversionProbe（MIP）,靶标富集,为了在大样本量中充分发挥新一代测序技术的潜能，科学家们开发出几种方法，来选择性富集目标区域。与全基因组测序相比，富集后再测序降低了成本，也减轻了后续数据分析的压力，让研究人员能够轻松利用新一代测序的通量。目前有几种靶向富集方法，包括分子倒置探针连接测序（MIPS）、基于寡核苷酸杂交三种富集技术：罗氏NimbleGen的SeqCap寡核苷酸杂交型芯片捕获，安捷伦的SureSelect寡核苷酸杂交溶液型捕获以及Raindance的多重PCR方法的方法。,三种富集技术比较,为了评估这些方法在ABISOLiD3系统上表现如何，来自迈阿密大学米勒医学院以及LifeTechnologies的研究人员评估了三种富集技术。结果发表在plosone上。对于三种方法来说，目标区域都是相同的，大约0.8Mb。富集以及测序之后，利用几个指标来分析SOLiD测序结果，包括各样品间覆盖深度的一致性、击中（on-target）和脱靶（off-target）效率、等位基因偏向以及与芯片数据的基因型一致性。,安捷伦的SureSelect表现出优异的击中效率以及各样品间读取深度的一致性。在读取深度为20倍及以下时，NimbleGen的性能很相似。Raindance和NimbleGenSeqCap的读取深度都更严格分布在平均值左右，但击中效率却不如SureSelect。在分析设计上，Raindance表现出最好的多功能性。它靶定了目标区域的97%，这对于诊断性的重测序可能很有用。,外显子测序转录组测序表达谱测序MeDIP-SeqChIP-Seq,7、OtherSequencingLibraryPreparation,外显子测序,转录组测序测序,转录组测序可以得到特定条件下所有mRNA转录本的丰度信息，从而发现新的转录本和可变剪接体基因表达谱(geneexpressionprofile)：指通过构建处于某一特定状态下的细胞或组织的非偏性cDNA文库,大规模cDNA测序,收集cDNA序列片段、定性、定量分析其mRNA群体组成,从而描绘该特定细胞或组织在特定状态下的基因表达种类和丰度信息,这样编制成的数据表就称为基因表达谱,表达谱测序,ChIP-sequencing,MeDIP-sequencing,BisulfiteSequencing,六、文库质量控制,基本指标浓度片段长度及均一度纯度评价方式紫外分光光度计微量定量：NanoDropetcAgilent耗材贵QuantitativePCRSequencinganalysis,Agilent2100Bioanalyzer,第二节测序模板制备技术介绍,新一代高通量测序：单分子多拷贝的获得滚环复制乳液PCR桥式PCR单分子测序,一、滚环复制（rolling-circleamplification）,技术起源DNA复制的一种方式优点恒温扩增高灵敏应用：SNP，甲基化，生物芯片，WGA等,CompleteGenomicsDNB,2012年9月17日中国深圳的国际领先基因技术公司深圳华大基因（华大基因）及人类全基因组测序的创新领导者CompleteGenomics,Inc.（纳斯达克：GNOM）（Complete），今日宣布双方已经达成确定性协议，华大基因在美国的全资子公司将向Complete发出现金收购要约，以每股3.15美元（不计利息）收购该公司所有股权。该提价较Complete于2012年6月4日最后的收盘价2.04美元，高出54的溢价。6月4日是Complete宣布开始考虑进行战略选择以确保继续为其医疗技术的商业化提供所需资金来源之前的最后一个交易日。,技术简介：水包油：大部分化妆品油包水乳液聚合：反应器生化反应器多重PCR反应BEAMing（bead、emulsion、amplification、magnetic）High-throughputSequencing,二、乳液PCR,1、乳液PCR454sequencing,文库制备乳液PCR玻璃纤维上进行固定加入测序反应需要的试剂主要是酶。1平方毫米的地方大概有480个这样的孔,SequencingWorkflowEmulsionPCR,SequencingWorkflowLoadingofPicoTiterPlateDevice,Welldiameter:averageof44m400,000readsobtainedinparallelAsingleclonallyamplifiedsstDNAbeadisdepositedperwell,DepositingDNAbeadsintothePicoTiterPlatedevice,Qualityfilteredbases,AmplifiedsstDNAlibrarybeads,2、乳液PCRSOLiD,乳液PCRSOLiD,BeadEnrichment,Templatedbeadsareseparatedfromnon-templatedbeadsviapolystyrenebeads,Pre-andPost-BeadEnrichmentP2-hybridization,BeadDeposition,Templatedbeadsaremodifiedattheir3-endandcovalentlyattachedtoaglassslide.,SlideConfigurations,三、桥式PCR（BridgePCR）,固相PCR：是将特定的引物寡核苷酸通过不同的方法共价固定在固相支持物上来扩增目的DNA。桥式固相扩增,桥式PCR（BridgePCR）,Illumina高通量测序芯片表面连接有一层单链引物，两端连接测序接头的单链DNA片段通过与芯片表面的引物碱基互补结合，引物延伸成为双链后，使双链变性成为单链，该单链DNA的一端就被“固定”在芯片上，而单链DNA的另一端随机和附近的另外一个引物互补，也被“固定”住，形成“桥（bridge）”。经过反复30轮扩增后，每个单分子得到了约1000倍扩增，成为单克隆“DNA簇”。,桥式PCR-Solexa,Isothermalamplificationmethodfornext-generationsequencing,Isothermalamplificationmethodfornext-generationsequencing,四、测序模板的固定,测序模板的固定,Templateimmobilizationa:emulsionPCR;b:composedtwobasicsteps:primingandextendingofthesingle-strandedsinglemoleculetemplate,bridgeamplificationoccurredadjacentprimerstoformcluster;c:immobilizationbyatemplate;d:immobilizationofapolymerase,目前高通量测样本制备中存在的主要问题,样本文库制备片段化特定片段选择文库预扩增等测序模板准备不同的制备方法（乳液，桥式）扩增酶的特性代表性降低！有效数据减少，甚至存在很大偏差。集成化，自动化，简单化能够较好的解决并将成为主流方向,第三节测序样本准备的自动化现状,一、样本核酸提取自动化设备,1、新一代的磁珠系统ThermoScientificKingFisherFlex,在15-30min内纯化96个样品；通过KingFisher系统的自动平行样品处理，样品之间的交叉污染和试剂浪费现象被有效消除；KingFisherFlex可与包括机械臂(Robotics)，液体处理系统(LiquidHandling)等在内的自动化设备联用，进一步增加KingFisherFlex的处理通量，满足高通量实验的需求。,KingFisher技术,KingFisher系列产品是适于分离DNA/RNA、蛋白和细胞的全自动提取纯化系统，专为解决客户现在和未来的所有纯化问题而设计。创新的产品基于专利的KingFisher技术(专利号US6447729,US6448092)，通过特制的磁棒吸附、转移和释放磁珠，从而实现磁珠/样品的转移，避免了液体处理过程，提高了自动化程度。KingFisher技术的工作原理如下图所示，样品、溶液和磁珠置于微孔板或管中，磁棒表面套有专门的磁套用于保护磁棒避免与样品/溶液/磁珠直接接触。,2、QIAGEN的QIAcube,QIAcube：将离心柱的操作自动化,QIAcube,二、安捷伦2200TapeStation自动化电泳系统,安捷伦科技公司今日发布了安捷伦2200TapeStation自动化电泳系统，以实现新一代测序流程中样品和文库质量控制的自动化。2200TapeStation配合预包装的即用型ScreenTape试剂耗材，能够简化和加快新一代测序工作流程中的质量控制。安捷伦2200TapeStation兼容16联条式样品卡和96孔板，是一款能够快捷测定生物样品质量的台式自动化系统。客户只需简单地将样品和ScreenTape消耗品载入一体式2200TapeStation仪器中，每个样品仅需约1分钟即可轻松获得蛋白质、RNA和DNA样品的完整分析结果。安捷伦还提供业内一流的用于新一代测序的SureSelect靶向序列捕获系统，它是溶液型杂交捕获技术，由安捷伦与麻省理工学院-哈佛大学博德研究所最先研发成功。与安捷伦2200TapeStation系统类似，SureSelect能够简化新一代测序的工作流程，便于研究人员仅对感兴趣的基因组区域进行测序,安捷伦2200TapeStation自动化电泳系统,Agilent2100Bioanalyzer,样本核酸质控片段选择纯化测序文库质控,三、相关自动化处理模块1、TecanFreedomEVO（75，100，150，200）,实现全自动FreedomEVP150大型平台的高通量方案(一次性处理1-96个样本)片断化文库的制备工作。Tecan公司的高通量测序样本制备解决方案集成了包括类似Covaris自适应聚焦超声DNA剪切断片化设备在内的样本制备过程所需的各种模块，从而实现高度重现的全自动样本制备。全自动的样本制备不仅节约了