分子生物学检验技术第3章

第三章蛋白质组与蛋白质组学,中南大学罗建新,第三章蛋白质组与蛋白质组学,DNA,mRNA,蛋白质,转录,翻译,基因,蛋白质,细胞特异性基因表达,生理状态,蛋白质相互作用,温度,应激状态,培养条件,药物作用,数量有限,结构相对稳定,复杂性,多变性,直接反应生命现象,复杂的调控,第三章蛋白质组与蛋白质组学,第一节蛋白质组与蛋白质组学的定义,第二节蛋白质组及其质点的分离与分析,第三节蛋白质相互作用的研究,第四节蛋白质数据库及其应用,第一节蛋白质组与蛋白质组学的定义,第一节蛋白质组与蛋白质组学的定义,蛋白质组protein+genomeproteome一种基因组所表达的全部蛋白质一个细胞或一个机体的基因所表达的全部蛋白质,蛋白质组学阐明生物体全部蛋白质的表达模式与功能模式从整体的角度分析、鉴定细胞内动态变化的蛋白质的组成、结构、性质、表达水平与修饰状态了解蛋白质之间、蛋白质与大分子之间的相互作用与联系,揭示蛋白质的功能与细胞生命活动的规律,一、蛋白质组与蛋白质组学的定义,第二节蛋白质组及其质点的分离与分析,一、分离纯化,第二节蛋白质组及其质点的分离与分析,二、分析鉴定,一、分离纯化,（二）破碎细胞,（三）蛋白质混合物的分离方法,（四）蛋白质分离纯化的条件,（一）选择材料,目的蛋白质的含量提取蛋白质的材料,一、分离纯化,（一）选择材料,一、分离纯化,（二）破碎细胞,机械法物理法化学法,根据蛋白质溶解度、分子大小及形状、电离性质、生物学功能的差异进行：1.根据溶解度2.根据分子量透析和超滤平衡离心凝胶过滤层析,（三）蛋白质混合物的分离方法,一、分离纯化,3.根据电荷毛细管电泳离子交换层析4.根据蛋白质的亲和能力亲和层析,一、分离纯化,（四）蛋白质分离纯化的条件,缓冲液盐、金属离子和螯合剂还原剂去垢剂蛋白酶抑制剂表面效应蛋白质的环境因素温度储存,一、分离纯化,二、分析鉴定,（三）图像分析技术,（四）放射性核素标记亲和标签法,（五）蛋白质芯片技术,（六）质谱技术,（一）Western印迹技术,（二）二维凝胶电泳（2-DE）技术,（七）其它方法,二、分析鉴定,（一）Western印迹技术基本操作步骤：蛋白样品的制备SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白质的电转移蛋白质与抗体的结合反应目标蛋白质的显示,western印迹基本步骤图示,（二）二维凝胶电泳（2-DE)技术,目前蛋白质组研究中最有效的分析鉴定技术之一由两相组成：第一相：等电聚焦凝胶电泳(根据蛋白质电荷差异)第二相：SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(根据蛋白质分子量差异),二、分析鉴定,二、分析鉴定,2-DE技术原理,2-DE分析的基本步骤,蛋白质溶解变性还原去除蛋白质杂志,利用不同pK固定化电解质配置不同pH范围的凝胶利用软件设计配置,第一相电泳(IPGIFE)平衡第二相电泳(SDSPAGE),考马斯亮蓝染色银染色铜染色,样品制备,IPG胶制备,双相电泳,染色,二、分析鉴定,2-DE获得的蛋白质图谱,二、分析鉴定,通过2-DE得到的蛋白质分离图谱，需要经过摄像或扫描转换为以像素为基础的、具有不同灰度强弱和一定边界方向的斑点电脑信号。,(三)图像分析技术,二、分析鉴定,2-DE图像分析软件包操作过程：,图像采集,斑点检测,背景消减,获得蛋白质相关信息,图像内及图像间的比较,二、分析鉴定,（四）放射性核素标记亲和标签法,正常细胞D0亲和标签,病理细胞D8亲和标签,混合并消化,生物素亲和纯化,液相色谱质谱联用分析,测量两个不同样品中蛋白质的相对丰度,二、分析鉴定,（五）蛋白质芯片技术,二、分析鉴定,原理样品分子离子化后，根据不同离子间的质量和电荷比值（m/e）的差异确定分子量。应用蛋白质的序列分析研究蛋白质的修饰,（六）质谱技术,二、分析鉴定,（七）其它方法,Edman降解法测定蛋白质多肽的排列顺序核磁共振（NMR）、荧光光谱法测定溶液中蛋白质分子的结构X射线衍射分析法、小角中子衍射法测定晶体蛋白质的分子结构等,二、分析鉴定,第三节蛋白质相互作用的研究,第三节蛋白质相互作用的研究,二、蛋白质核酸,一、蛋白质蛋白质,一、蛋白质蛋白质,（二）蛋白质之间的相互作用力,（三）蛋白质相互作用的研究方法,（一）蛋白质-蛋白质相互作用的形式,（一）蛋白质-蛋白质相互作用的形式1.蛋白质亚基的聚合2.交叉聚合3.分子识别4.分子的自我装配5.多酶复合体,一、蛋白质蛋白质,（二）蛋白质之间的相互作用力,氢键范德华力疏水键离子键,一、蛋白质蛋白质,一、蛋白质蛋白质,（三）蛋白质相互作用的研究方法,1.酵母双杂交系统,2.噬菌体展示,3.生物传感芯片质谱,4.定点诱变技术,蛋白质亲和层析亲和印迹免疫沉淀交联酵母双杂交噬菌体展示生物传感芯片质谱蛋白质工程中的定点诱变技术,一、蛋白质蛋白质,研究方法,传统技术,新技术,1.酵母双杂交系统,DNA-BD具有与报告基因转录调控区特异结合的功能，DNA-AD则具有活化转录的功能。,报告基因,一、蛋白质蛋白质,DNA-BD和DNA-AD分开时不能激活转录，只有当两者在空间上接近时，才能呈现转录因子的活性。只有当蛋白质X与蛋白质Y间发生相互作用时，才能激活报告基因的转录，而当两者单独作用时均无此功能。,一、蛋白质蛋白质,二、蛋白质-核酸,（二）滤膜结合,（三）甲基化干扰,（四）DNase足纹,（五）核酸-蛋白质杂交,（一）凝胶滞后试验,二、蛋白质-核酸,（一）凝胶滞后试验蛋白质可以与末端标记的核酸探针特异性结合，所形成的复合物电泳时在凝胶中的泳动速度比未与蛋白结合的游离探针慢，即表现为相对滞后该实验可以评价蛋白与核酸结合的特异性,（二）滤膜结合法,利用硝酸纤维素滤膜不能结合双链DNA，但可与蛋白质结合的特性，将与蛋白质结合的DNA片段与游离DNA片段分离开。,二、蛋白质-核酸,（三）甲基化干扰,经甲基化修饰的DNA探针可以干扰蛋白质的结合。将DNA甲基化后与蛋白质进行反应，只有在结合位点上未被修饰的DNA片段才能与蛋白质结合。,DNA探针的末端标记及探针的甲基化,蛋白质与甲基化探针的结合及DNA蛋白质结合探针的分离,结合物及对照探针的化学切割,DNA片段的序列测定,二、蛋白质-核酸,二、蛋白质-核酸,用特殊方法将DNA从被修饰的碱基处进行切割，并经电泳分离，由于未结合蛋白质的DNA可在随机修饰的位点被切割，而结合蛋白质的DNA在结合位点上未被修饰而不能被切割，由此可获得蛋白质与核酸定位结合的信息。,（三）甲基化干扰,（四）DNase足纹,目前广泛用于蛋白质精确结合位点的研究方法原理：DNase可以随机水解核苷酸中的磷酸二酯键，将DNA切成单核苷酸，而结合有蛋白质的DNA免于DNase的水解。,二、蛋白质-核酸,DNase足纹分析原理示意图,（五）核酸-蛋白质杂交实验,TBE缓冲液中DNA蛋白质杂交,放射自显影,用于鉴定蛋白质与DNA的特异性结合和确定结合蛋白质的分子量。基本步骤：,蛋白质杂交,SDS-PAGE,转移至NC膜或Nylon膜,缓慢复性、封闭、预杂交,加入同位素标记的DNA片段作探针,多次洗膜,二、蛋白质-核酸,第四节蛋白质数据库及其应用,第四节蛋白质数据库及其应用,二、蛋白质数据库的应用,一、蛋白质数据库(ProteinDatabase),一、蛋白质数据库,（一）蛋白质序列数据库,（二）蛋白质结构数据库,（三）蛋白质直系同源簇数据库,（四）DIP数据库,一、蛋白质数据库,（一）蛋白质序列数据库SWISS-PROT数据库：http:/www.ebi.ac.uk/swissprotPIR和PSD数据库//pir,蛋白质数据库/pdb/蛋白质结构分类数据库http:/scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop/PROSITE数据库http:/www.expasy.ch/proside/,（二）蛋白质结