入噬菌体及质粒载体...ppt

-噬菌体及质粒载体,郭苋2014212346,噬菌体的一般生物学特性,依赖于寄主细胞存活。脱离了寄主细胞后既不能生长也不能复制。基本功能：保护自己的核酸分子（DNA或RNA）免遭环境化学物质的破坏将其核酸分子注入到被感染的细菌细胞经被感染的细菌细胞转变成制造噬菌体的体系，从而能产生出大量的子代噬菌体颗粒。使感染的细菌细胞释放出子代噬菌体颗粒,噬菌体载体,1噬菌体的分子生物学概述2噬菌体载体,1噬菌体的分子生物学概述,噬菌体颗粒中的DNA是一线性双链DNA分子，长48502bp，两端各有12个碱基的5凸出黏性末端是互补的。进入细胞的DNA通过两端的黏性末端环化。可用来构建柯斯质粒。噬菌体上有些基因可被取代而不影响其生活周期。,噬菌体基因组编码基因区域,左侧区：自基因A到基因J，包括参与噬菌体头部蛋白质和尾部蛋白质合成所需要的全部基因。中间区：介于基因J与基因N之间，这个区又称为非必要区。本区基因与保持噬菌斑形成能力无关，但包括了一些与重组有关的基因（redA和redB）。以及整合到大肠杆菌染色体中去的int基因。和把原噬菌体从寄主染色体上删除出去的xis基因。右侧区：位于基因的右侧，包括全部主要的调控成分，噬菌体复制基因（和）以及溶菌基因（和）,注意,噬菌体感染了寄主细胞之后，究竟是发生溶菌反应还是溶源反应，这是由cI基因和cro基因编码的蛋白质，同噬菌体的两个操纵基因（OL,OR)之间的相互作用来决定的。如果这两个操纵基因都已摆脱了阻遏状态，那么噬菌体便可以进入溶菌周期，否则进行溶源周期。,构建噬菌体载体的基本原理,野生型的噬菌体DNA，对大多数基因克隆中常用的核酸内切酶都有过多的限制位点，通过消除一些多余的限制位点和切除非必要的区段，才可能将它改造成适用的克隆载体。,插入型载体替换型载体,噬菌体载体可分为：,插入型载体,免疫功能失活的插入型载体：载体基因组上存在一段免疫区，其中带有一两种核酸内切限制酶的单切割位点。当外源DNA插入到这种位点上时，就会使载体所具有的合成性阻遏物的功能遭受到破坏，而不能进入溶源周期。因此带有外源DNA插入的重组体都只能形成清晰的噬菌斑，而没有外源DNA插入的亲本噬菌体就会形成浑浊的噬菌斑。,-半乳糖苷酶失活的插入型载体,载体基因组中含有一个大肠杆菌的lac5区段，编码着-半乳糖苷酶基因lacZ。由这种载体感染到的大肠杆菌lac-指示菌，涂布在添加IPTG和Xgal的培养基上就会形成蓝色的噬菌斑。,替换型载体,噬菌体的中央部分有一个可以被外源插入的DNA分子所取代的DNA片段的克隆载体。中央可取代片段两侧的多克隆位点是反向重复序列。因此当外源DNA插入时，一对克隆位点之间的DNA片段便会被置换掉，从而有效的提高了克隆外源DNA片段的能力。,噬菌体载体的特点,(1)筛选简便；(2)可克隆的片段大，最大可达23kb，而质粒最大仅10kb左右；(3)转化效率高。,注意：噬菌载体作为载体，其重组噬菌体DNA大小只能：38kb52kb。体外包装：噬菌载体+尾部蛋白+头部蛋白,噬菌体载体是主要用于cDNA文库构建，也经常用于外源目的基因的克隆。,噬菌体载体的改良,围绕三个目的进行：设计可对重组体分子作正选择的克隆载体，构建可方便的通过转录作用制备外源DNA插入序列之RNA探针的克隆载体发展可使插入的真核cDNA与-半乳糖苷酶形成融合蛋白质的克隆载体。,质粒载体,质粒特点,染色质外的双链共价闭合环形DNA（covalentlyclosedcircuarDNA,cccDNA）可自然形成超螺旋结构，不同质粒大小在2-300kb之间，15kb的小质粒比较容易分离纯化，15kb的大质粒则不易提取。能自主复制，是能独立复制的复制子（autonomousreplicon）。一般质粒DNA复制的质粒可随宿主细胞分裂而传给后代。质粒对宿主生存并不是必需的，某些质粒携带的基因功能有利于宿主细胞的特定条件下生存。,质粒载体的种类,在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。人工构建的质粒可以集多种有用的特征于一体，如含多种单一酶切位点、抗生素耐药性等。常用的人工质粒运载体有pBR322、pSC101。pBR322含有抗四环素基因(Tcr)和抗氨苄青霉素基因(Apr)，并含有27种限制性内切酶的单一识别位点。,质粒载体的优缺点,质粒载体主要用于DNA分子的亚克隆，表达外源蛋白，DNA序列的测定和基因的体外重新构建等。1.与外源DNA重组操作简便；2.外源DNA在质粒载体中相对较稳定，3.质粒DNA的制备和纯化方便，快速简单，所以得到广泛应用。缺点：1.它容纳外源DNA片段有限，通常最多为15kb左右，因为当质粒大于15kb时，转化效率明显下降。,理想的质粒载体,(1)分子量小、多拷贝、松弛控制型;(2)具有多种常用的限制性内切酶的单切点;(3)能插入较大的外源D