3.第三章 发酵学第二假说(2)发酵原理 张星元

2020/5/5,张星元：发酵原理,1,第二节微生物代谢网络的向心板块,2020/5/5,张星元：发酵原理,2,代谢网络中，胞外碳架物质跨膜并注入中心板块所流经的途径统称向心途径，向心途径群组成代谢网络的向心板块。,2020/5/5,张星元：发酵原理,3,3.2.1向心途径在代谢网络及其在细胞机器工作模式中的位置3.2.2微生物的分解代谢途径和代谢网络的向心途径,2020/5/5,张星元：发酵原理,4,3.2.1向心途径在代谢网络和细胞机器工作模式中的位置,2020/5/5,张星元：发酵原理,5,碳架物质从向心板块注入中心板块（前述中心代谢途径上的12个前体代谢物的大平台）时所流经的代谢途径统称向心途径。与整个代谢网络一样，向心途径的变化也取决于遗传与环境条件，本课程讨论的内容建立在微生物细胞相对稳定的代谢基础上。在工业发酵的细胞机器工作模式中，向心途径首当其冲，是工业发酵载流路径的一部分。,2020/5/5,张星元：发酵原理,6,向心途径在细胞机器工作模式中的位置,向心途径,中心代谢途径,离心途径,2020/5/5,张星元：发酵原理,7,3.2.2微生物的合成代谢途径和代谢网络中的向心途径,2020/5/5,张星元：发酵原理,8,化能异养型微生物可以广泛地利用各种各样的有机物进行生长和繁殖。在发酵工业上发酵生产的原料大多是农副产品。微生物必须能合成并分泌能分解这些原料的酶，把原料转化成可以进入细胞的有机营养物质。,2020/5/5,张星元：发酵原理,9,各种有机营养物质（包括经水解酶降解形成的有机营养物质）大多以主动输送的方式进入原核生物的细胞，以促进扩散和主动输送的方式进入真核微生物的细胞，这几种输送方式均需借助于细胞的蛋白质（载体蛋白或酶）。,2020/5/5,张星元：发酵原理,10,进入细胞的营养物质若是中心代谢途径的起始物或中间产物，即可纳入中心代谢途径进行代谢；进入细胞的营养物质若不是中心代谢途径的起始物或中间产物，则需经向心途径的胞内部分，转化成中心代谢途径的起始物或中间产物，才可纳入中心代谢途径进行代谢。,2020/5/5,张星元：发酵原理,11,化能异养型微生物细胞借助于微生物的向心途径将有机化合物降解或转化成中心途径上对应的的化合物，从而使这两种途径衔接起来。微生物的向心途径一般依次包括三个部分：（1）胞外降解途径（胞外酶催化）（2）跨膜系统（有载体蛋白参与）（3）胞内向心途径,2020/5/5,张星元：发酵原理,12,原料化合物经向心途径注入中心途径，向心途径与中心途径的接合点（接口）原则上可以是中心途径上的任意化合物，实际上主要是12个代谢前体物。如果进入细胞的营养物质已经是中心代谢途径的起始物或中间产物，则胞内向心途径就缩成一个“点”，这个点也就是向心途径与中心途径的接口。代谢网络的向心途径往往是分解代谢途径，但它们是以中心大平台，或者更精确地说是以中心途径上对应的化合物为终点的。,2020/5/5,张星元：发酵原理,13,2020/5/5,张星元：发酵原理,14,2020/5/5,张星元：发酵原理,15,胞外降解途径：胞外酶催化多聚物的水解有载体蛋白参与的跨膜系统化能异养型微生物对各种有机化合物的利用细胞内源化合物的氧化降解关于质粒编码的降解代谢活性,2020/5/5,张星元：发酵原理,16,胞外降解途径：胞外酶对多聚物的水解微生物可以分泌胞外酶，大多数情况下是水解酶，把多聚物水解成可以进入细胞的分子。这些胞外酶游离于微生物细胞外，有些仍与细胞相联。细胞还会分泌一些附着物，使某些疏水化合物结合到细胞表面，以便于降解。多聚物水解不会产生可被生物利用的能量，但多聚物水解是向心途径的第一步。,2020/5/5,张星元：发酵原理,17,可作为营养的多聚物包括：淀粉、纤维素、果胶类物质（果胶酸、果胶、原果胶质）、几丁质（甲壳质）、半纤维素(hemicellulose)、木质素(1ignin)、蛋白质和多肽、核酸等等种类。化能异养型微生物能分泌一系列胞外酶将外源性多聚有机化合物降解。还有些有机化合物虽然不是多聚物，也需要首先被微生物的胞外酶水解以后才能被微生物吸收。例如许多微生物能分泌脂肪酶，它能将甘油三脂水解成脂肪酸和甘油。,2020/5/5,张星元：发酵原理,18,有载体蛋白参与的跨膜系统（第二章2.2.2已有叙述。）,2020/5/5,张星元：发酵原理,19,化能异养型微生物对各种有机化合物的利用微生物通过一定的机制从培养基中吸收有机化合物，进入细胞的有机化合物再经过一段代谢途径的代谢作用，将碳架物质注入中心代谢途径。这些有机化合物可以是碳水化合物、烃类化合物、含氮有机化合物或其他有机化合物。,2020/5/5,张星元：发酵原理,20,微生物通过一定的机制从培养基中吸收有机化合物，进入细胞的有机化合物再经过一段代谢途径的代谢作用，将碳架物质注入中心代谢途径。这些有机化合物可以是碳水化合物、烃类化合物、含氮有机化合物或其他有机化合物。,2020/5/5,张星元：发酵原理,21,二糖的吸收和降解关于二糖的吸收和降解，研究得最清楚的要数乳糖。大肠杆菌若要在以乳糖为碳源的培养基中生长，首先要诱导出3种酶：乳糖透性酶、-半乳糖苷酶和-半乳糖苷乙酰基转移酶。,2020/5/5,张星元：发酵原理,22,乳糖透性酶实际上是乳糖的载体蛋白，用于乳糖的主动输送，将乳糖送入细胞；-半乳糖苷酶将乳糖水解成葡萄糖和半乳糖；-半乳糖苷乙酰基转移酶的作用是催化AcCoA将乳糖及其它半乳糖苷乙酰化的反应，它可将未能代谢的乳糖及与乳糖结构类似的分子乙酰化，并将其排出细胞，因此，这个酶的生物学功能可能是起解毒作用。,2020/5/5,张星元：发酵原理,23,乳糖水解生成的葡萄糖被磷酸化而进入酵解途径；水解生成的半乳糖又在细胞中诱导出参与半乳糖进一步代谢的3种酶，在这3种酶的协同作用下，使半乳糖转化成G-6-P，即可注入酵解途径。,2020/5/5,张星元：发酵原理,24,二糖的降解一般在细胞内发生，有如下两种降解方式：一种是被相应的二糖水解酶水解成单糖，如蔗糖酶将蔗糖水解成葡萄糖和果糖，乳糖酶（-半乳糖苷酶）将乳糖水解成葡萄糖和半乳糖，麦芽糖酶将麦芽糖水解成两份葡萄糖。另一种分解方式是在相应的磷酸化酶的作用下，使二糖经磷酸化裂解（phosphorylyticcleavage），得到1分子单糖和1分子磷酸葡萄糖。,2020/5/5,张星元：发酵原理,25,这种方式的裂解比起第一种方式更为经济，由这种方式产生磷酸葡萄糖即可以糖的磷酸酯的形式进入中心代谢途径，而且，此过程不消耗ATP，而游离的单糖大多需经激活（消耗高能键而被磷酸化）后才能进入葡萄糖的降解途径。,2020/5/5,张星元：发酵原理,26,己糖和戊糖的降解作为化能异养型微生物的碳源与能源，果糖像葡萄糖一样，受己糖激酶催化而被ATP激活，生成F-6-P；或者借助由PEP参加的磷酸转移酶系统进入细胞，生成F-1-P。然后又在1-磷酸果糖激酶（该酶受果糖诱导）的催化下形成F-1,6-2P。F-6-P和F-1,6-2P均为EMP途径中间产物，可按EMP途径进一步降解。,2020/5/5,张星元：发酵原理,27,甘露糖在甘露糖激酶的催化下，生成6-磷酸甘露糖，再由6-磷酸甘露糖异构酶催化，生成F-6-P，进入EMP途径。也有例外，如果没有甘露糖激酶，也可以以另外的方式实现甘露糖的磷酸化。,2020/5/5,张星元：发酵原理,28,半乳糖诱导3种酶的合成：半乳糖激酶、葡萄糖1-磷酸半乳糖尿苷酰转移酶和UDP-Glc差向异构酶。半乳糖在这些酶的顺序催化下，先生成1-磷酸半乳糖，然后再生成G-1-P。G-1-P经G-6-P磷酸葡萄糖变位酶作用生成G-6-P，即可进入酵解途径。在嗜糖假单胞菌中，半乳糖可被直接氧化成半乳糖酸内酯，然后进入与ED途径类似的途径，最终产物与ED途径相同。,2020/5/5,张星元：发酵原理,29,戊糖，如核糖、木糖和阿拉伯糖，虽然可以被不少微生物利用，但常有适应现象。即它们或以自己独立的途径降解，或经转化后进入葡萄糖降解途径。如核糖在激酶催化下生成R-5-P，即可进入HMP和PK途径。阿拉伯糖在异构酶的催化下生成核酮糖，然后再磷酸化生成Ru-5-P，即可进入HMP或PK途径。,2020/5/5,张星元：发酵原理,30,木质纤维水解物中有40是木糖，木糖可以经木糖醇而转化为木酮糖，也可以在木糖异构酶催化下直接生成木酮糖，木酮糖经激酶催化生成Xu-5-P，即可进入HMP或PK途径。,2020/5/5,张星元：发酵原理,31,己糖醛酸的降解果胶类物质在胞外酶作用下降解成半乳糖醛酸。半乳糖醛酸经进一步代谢即可转化成ED途径的中间产物KDPG，即可进入ED途径。这样的作用在假单胞菌、气单胞菌和土壤杆菌中比较明显。,2020/5/5,张星元：发酵原理,32,甘露（糖）醇的降解在不同的微生物中，可能经不同的途径将甘露醇转化为EMP途径的中间产物F-6-P。,2020/5/5,张星元：发酵原理,33,丙酸的降解在需氧条件下，大肠杆菌的丙酸降解至今未有明确的结论，其丙酸代谢的第一步是生成丙酰CoA，后者与乙醛酸缩合成-羟基戊二酸，然后又裂解成乳酸和乙酸。乙酸经AcCoA进入TCA环或（和）DCA环。而乳酸经乳酰CoA、丙酮酰CoA，转化成羟基丙酮醛，此化合物的进一步代谢情况尚待研究，但已知当丙酸浓度较高时，丙酸主要经乙酸代谢。,2020/5/5,张星元：发酵原理,34,葡萄糖酸的降解某些微生物能利用葡萄糖酸作为唯一碳源，葡萄糖酸可经6-磷酸葡萄糖酸脱羧，生成5-磷酸核酮糖而进入HMP途径；也可以经2,5-二酮葡萄糖酸，继续代谢生成-KG而进入TCA环。在假单胞菌中，葡萄糖酸经6-磷酸葡萄糖酸进入ED途径。,2020/5/5,张星元：发酵原理,35,山梨（糖）醇的降解山梨（糖）醇先被转化成果糖，然后生成F-6-P而进入EMP途径。苹果酸的降解在需氧情况下，苹果酸按TCA环氧化方向生成OAA，然后OAA脱羧生成PYR，然后按需氧途径降解。在弱氧化醋酸杆菌中，苹果酸经草酰苹果酸生成-KG而进入TCA环，以便用于氨基酸合成。,2020/5/5,张星元：发酵原理,36,草酸的降解草酸先被转化成乙醛酸，然后经甘油酸途径生成3-P-GA进入EMP途径。乙醇酸（羟基乙酸）和乙醛酸的降解乙醇酸先被氧化成乙醛酸，后者直接与AcCoA反应，生成苹果酸进入TCA环、DCA环；或者乙醛酸经甘油酸途径，生成3-P-GA而进入EMP途径。,2020/5/5,张星元：发酵原理,37,乙醇和乙酸的降解乙醇经乙醛氧化成乙酸，乙酸在乙酰硫激酶的催化下，与CoA、ATP作用，生成AcCoA而进入TCA环。,2020/5/5,张星元：发酵原理,38,脂肪酸的降解脂肪和脂肪酸也可以作为微生物的碳源和能源，但脂肪不能进入细胞，细胞内贮藏的脂肪也不可直接进入糖的降解途径，因此要在有关酶的作用下先行水解。脂肪在微生物细胞合成的脂肪酶（胞外酶对胞外的脂肪，胞内酶对胞内脂肪）的作用下，水解成甘油和脂肪酸。甘油经3-磷酸甘油或经二羟基丙酮转化成磷酸二羟丙酮（DHAP）进入EMP途径。,2020/5/5,张星元：发酵原理,39,绝大多数细菌对脂肪酸的分解能力很弱，然而一经诱导，它们的脂肪酸氧化活性就会增强。如大肠杆菌就有一个可被诱导合成的，用来降解脂肪酸的酶系，并且，C6C16脂肪酸靠酰基CoA合成酶参与的基团转移机制进入细胞。,2020/5/5,张星元：发酵原理,40,脂肪酸的-氧化是在原核细胞的细胞质和真核细胞的线粒体内进行的。若脂肪酸分子的碳原子数为偶数，最终得AcCoA，若脂肪酸分子的碳原子数为奇数，则同时也得到丙酰CoA。AcCoA直接进入TCA环降解，丙酰CoA则可以经甲基丙二酸单酰CoA，然后甲基丙二酸单酰CoA分子重排，形成ScCoA而进入TCA环。,2020/5/5,张星元：发酵原理,41,脂肪族烃的降解微生物对烃的降解，首先需要氧，因此，在烃上生长是专性需氧的过程。在甲烷上生长的过程，需特殊的途径，因此甲烷氧化细菌不能在其它烃上生长。微生物对其它脂肪族烃的代谢情况大致是这样的：能够在C5C8脂肪族烃中生长的细菌相对较少，如分支细菌、黄杆菌、诺卡氏菌等。,2020/5/5,张星元：发酵原理,42,然而，能利用长链的脂肪族烃的微生物比较多，分布也比较广，其中特别是能利用C10C18正烷烃的微生物，而且这些正烷烃被利用的速度特别快。能在长链脂肪族烃上生长的微生物包括谷氨酸棒状杆菌、荧光假单胞菌、铜绿假单胞菌、嗜石油诺卡氏菌、简单节杆菌、解脂假丝酵母、球拟酵母、粉红头孢等微生物。值得注意的是酵母和丝状真菌也能利用这类基质。大肠杆菌、产气肠杆菌和枯草芽孢杆菌不能在这类基质上生长。,2020/5/5,张星元：发酵原理,43,脂肪族烃是水不溶性基质，因此，微生物对它们的吸收和催化作用就有一定的特殊性。微生物通常生活在水的环境中，不能生活在油中，因此，微生物对这类基质的作用只发生在油水界面上。对于这类基质的利用是从对它们的吸收开始的。在这类基质上生长的酵母细胞具有富含糖脂的相当厚的壁，在这类基质上生长的细菌则形成含海藻糖脂、鼠李糖脂或具有与这些糖脂类结构类似的化合物的细胞壁。,2020/5/5,张星元：发酵原理,44,脂肪族烃溶在这样的细胞壁中并且被传送到质膜。换句话说，这些微生物能产生起乳化剂作用的物质，这些物质具有既亲油又亲水的分子结构，因而可以促进微生物对脂肪族烃的吸收。例如节杆菌、短杆菌、棒状杆菌和诺卡氏菌产生的这类物质是海藻糖脂（由1分子海藻糖与2分子。-分支-羟基脂肪酸组成），嗜石油假丝酵母产生的这类物质是由多肽和脂肪酸组成的。,2020/5/5,张星元：发酵原理,45,当然也可以用人工的方法增加微生物细胞的这种吸收活性，比如，加入表面活性剂促进乳化作用，使烷烃呈胶状分散状态。对于固态烃（如固体石蜡），除了细胞直接黏附于其表面外，还可能有使其溶解的机制。,2020/5/5,张星元：发酵原理,46,脂肪族烃被微生物吸收过程的最初的3个反应在膜中进行，催化这3个反应的酶是与膜结合的。反应由单加氧酶催化开始：基质-HO2AH2基质-OHAH2O,2020/5/5,张星元：发酵原理,47,上式中AH2是指一种可被氧化的辅基质（cosubstrate），这里是还原性的红氧（化）还（原）蛋白（reducedrubredoxin），这种含铁的蛋白质小分子（Fe2+或Fe3+与多肽链上的半胱氨酸残基相联），先被可溶性的依赖NADH的酶系统还原，然后才能作为单加氧酶的辅基质。,2020/5/5,张星元：发酵原理,48,然后，经单加氧酶催化形成的伯醇被依赖于NAD+的伯醇脱氢酶进一步氧化成对应的醛，最后醛又被依赖于NAD+的醛脱氢酶氧化成对应的脂肪酸。此外，还发现有脂肪族烃分子两端均被氧化的，结果生成二羧酸。,2020/5/5,张星元：发酵原理,49,在棒状杆菌的一些种和酵母中，辅基质则是还原性细胞色素P450，它经黄素蛋白和铁硫蛋白，从NADH获得还原力。,2020/5/5,张星元：发酵原理,50,在某些微生物中（如诺卡氏菌中的某些种）还发现了另外一种氧化机制。从脂肪族烃的亚末（即第二个碳）开始氧化，生成仲醇，继续氧化成酮；在第二个单加氧酶的催化下转化成乙酸酯；乙酸酯水解成乙酸和长伯链醇；这个长链伯醇将进一步降解。脂肪族烯也能被降解。或是在双键处加水；或是先形成环氧化物，然后水解成二羟基烷。此外，环烷烃、二环烷烃、萜烯烃类等均可被不同的微生物降解。,2020/5/5,张星元：发酵原理,51,总之，不同种类的长链脂肪族烃通过不同途径均可被转变成长链脂肪酸，长链脂肪酸经-氧化，生成AcCoA而进入TCA环。,2020/5/5,张星元：发酵原理,52,氨基酸的降解由蛋白酶或肽酶水解蛋白质或多肽生成的低分子质量的肽和氨基酸，能被许多种微生物主动吸收，并用于生长。一些氨基酸的分子结构与中心代谢途径上某些中间化合物（centralintermediates）相关，所以它们的降解非常容易。,2020/5/5,张星元：发酵原理,53,大多数情况下，氨基酸首先转变成相关的酮酸。如Glu-KG、AspOAA、AlaPYR，以及Val2-氧代异戊酸、Leu2-氧代异己酸、I1e2-氧代-3-甲基戊酸。这就是氧化脱氨。-KG、OAA和PYR属于中心代谢途径的中间化合物。2-氧代异戊酸和2-氧代-3-甲基戊酸还需经特异性的降解途径转变成中心代谢途径的中间化合物，已发现细菌中有与动物中类似的反应将这两者转化为AcCoA和丙酰CoA。,2020/5/5,张星元：发酵原理,54,脱氨也可以引发氨基酸的降解。发生脱氨反应的条件是：-氨基羧酸分子中-碳原子上的取代基（如羟基）促进-氨基的离去，生成酮酸。因而诸如Ser、Thr和His都可以进行脱氨降解。因为脱氨降解是从脱水开始的，所以把反应所用的酶叫做脱水酶（即通常所说的脱氨酶）。,2020/5/5,张星元：发酵原理,55,在大肠杆菌中降解代谢的Thr脱水酶与合成代谢的Thr脱水酶在性质上是不同的（特别是在调节性能上），后者催化从Thr合成I1e的第一步反应。如果要在Asp上需氧生长，许多微生物会合成天冬氨酸酶，催化Asp脱氨。His的降解也由类似的反应引发。,2020/5/5,张星元：发酵原理,56,以上所述脱氨机制是微生物降解氨基酸的主要机制，此外还有其他降解机制，如Arg可通过多种途径降解成SCA，Phe可以降解成FMA和乙酰乙酸。因此，许多微生物能在营养液和其他含有多种氨基酸和肽的培养基中很好地生长的事实，是可以理解的。,2020/5/5,张星元：发酵原理,57,但应注意到，氨基酸也可以在脱羧酶的催化下脱羧生成相应的胺。含1个氨基的氨基酸脱羧后生成单胺；含2个氨基的氨基酸脱羧后生成二胺，二胺有毒。,2020/5/5,张星元：发酵原理,58,核苷酸、核苷和嘌呤、嘧啶的降解化能异养型微生物可以分泌胞外酶，如核酸酶（磷酸二酯酶）、核苷酸酶（磷酸单酯酶）和核苷酶，将胞外的核酸降解成核苷酸、核苷、嘌呤和嘧啶。一般认为核苷酸难以被吸收，腺嘌呤核苷酸借助特异性的移位酶的跨膜交换比率为11。,2020/5/5,张星元：发酵原理,59,核苷和嘌呤、嘧啶碱基可以通过基团转移等机制进入胞内。胞内的核酸、核苷酸、核苷可被胞内相应的酶降解成嘌呤和嘧啶。这个分解过程可以概括为：核酸核苷酸（核苷磷酸）嘌呤或嘧啶（1-磷酸戊糖）嘌吟、嘧啶若要作为能源，则需要降解。嘌呤与嘧啶降解的最后产物是有机酸（氨基酸）、NH3和CO2。,2020/5/5,张星元：发酵原理,60,芳香族化合物的降解芳香族化合物在环境和食品中的累积会危及人类的健康（芳香族氨基酸无毒），人类希望能利用微生物来降解芳香族化合物，使它们重新进入大自然的碳素循环。,2020/5/5,张星元：发酵原理,61,芳香族化合物（萘、蒽、菲、苯乙醇酸、色氨酸、奎尼酸等）大多先被转变成儿茶酚（邻苯二酚）和原儿茶酸（3，4-二羟苯甲酸）。然后儿茶酚和原儿茶酸再经邻位分解（3-氧代己酸途径）降解成SCA和AcCoA；或儿茶酚和原儿茶酸经间位分解（间位分解途径）降成PYR和乙醛。因此，儿茶酚和原儿茶酸堪称芳香族化合物分解的“中心代谢物”。,2020/5/5,张星元：发酵原理,62,微生物也可以不经过以上途径降解芳香族氨基酸。Phe和Tyr经尿黑酸（2,5-二羟苯乙酸）降解为延胡索酸和乙酰CoA，即可进入TCA环。,2020/5/5,张星元：发酵原理,63,细胞内源化合物的氧化降解当没有外源能源化合物供应时，微生物可以氧化其细胞内组成物质（即内源营养物质），获得维持生命活动的能量。内源营养物质包括细胞内的各种多糖、类脂和多聚-羟基丁酸、细胞蛋白质和RNA等。,2020/5/5,张星元：发酵原理,64,当前面3种能被较快降解的内源营养物质用完后，细胞常常能利用细胞蛋白质和RNA。以上内源营养物质的降解途径除-羟基丁酸外，前面均已讨论过了。多聚-羟基丁酸的降解始于解聚，得到-羟基丁酸，然后-羟基丁酸被最终降解成AcCoA。,2020/5/5,张星元：发酵原理,65,关于质粒编码（Plasmid-encoded）的降解代谢活性前面所述的各种降解途径均是由染色体DNA编码的。近年来发现在恶臭假单胞菌和一些相关的种的微生物细胞中含有降解性质粒（degradativeplasmids），它们包含某些特殊的降解代谢的酶（酶系）合成的遗传信息。,2020/5/5,张星元：发酵原理,66,首先发现的是编码樟脑降解酶系的质粒，后来还发现恶臭假单胞菌的烷烃氧化作用，受正辛烷质粒（octaneplasmid）的控制，这个质粒为可诱导的烷烃羟化酶和伯醇脱氢酶编码，而染色体DNA则为用于伯醇、脂肪醛和脂肪酸降解的组成型的氧化酶编码。,2020/5/5,张星元：发酵原理,67,以上所述的氧化降解过程都是正常情况下的代谢，也就是说没有受到内外条件制约的情况下的降解代谢。,2020/5/5,张星元：发酵原理,68,工业发酵过程中，除了要获得菌体，微生物往往是处于制约条件下的不完全氧化状态(incompleteoxidationunderstresscondition)。已开发的工业发酵过程，诸如D-葡萄糖酸、柠檬酸和味精的生产，在这些发酵过程中，生产菌种因条件约束，被迫大量分泌工业发酵的产物被微生物完全氧化的中间代谢产物相对很少。,2020/5/5,张星元：发酵原理,69,不完全氧化是微生物令人感兴趣的性质，所谓不完全氧化，指的是在这过程中还没有被完全氧化的有机化合物作为工业发酵的终端产物排出细胞，这个过程对工业发酵是十分重要的。,2020/5/5,张星元：发酵原理,70,第三节微生物代谢网络的离心板块,2020/5/5,张星元：发酵原理,71,代谢网络中，碳架物质离开中心板块所流经的代谢途径统称离心途径，离心途径群组成代谢网络的离心板块。,2020/5/5,张星元：发酵原理,72,3.3.1离心途径在代谢网络和细胞机器工作模式中的位置3.3.2微生物的合成代谢途径和代谢网络中的离心途径,2020/5/5,张星元：发酵原理,73,3.3.1离心途径在代谢网络和细胞机器工作模式中的位置,2020/5/5,张星元：发酵原理,74,在微生物细胞代谢的过程中碳架物质从中心板块流向离心板块。离心板块主要由离心代谢途径（centrifugalmetabolicpathway）组成。碳架物质从中心板块离开所流经的代谢途径，统称离心途径。在工业发酵的工作模式中，离心途径也是工业发酵载流路径的一部分。离心途径的变化也取决于遗传与环境条件，本节讨论的内容建立在微生物细胞相对稳定的代谢基础之上。,2020/5/5,张星元：发酵原理,75,离心途径在细胞机器工作模式中的位置,2020/5/5,张星元：发酵原理,76,3.3.2微生物的合成代谢途径和代谢网络的离心途径,2020/5/5,张星元：发酵原理,77,TCA环和DCA环底物的回补分子模块等的生物合成能量代谢副产物的合成离心途径终产物的跨膜机制,2020/5/5,张星元：发酵原理,78,离心途径始发于中心途径上对应的化合物，这些化合物将中心途径与离心途径衔接起来，成为这两种途径的“接口”。微生物的离心途径一般依次包括两个部分：（1）胞内离心途径（2）跨膜送出系统或通透机制,2020/5/5,张星元：发酵原理,79,从初级代谢网络中心板块的前体代谢物出发，经胞内离心途径可以合成细胞的各种初级代谢产物和能量代谢副产物；其中有些可能透出或被输送出细胞（成为工业发酵的产物），有些直接参与细胞自身的生长和繁殖（在这种情况下就没有上述的跨膜部分）。,2020/5/5,张星元：发酵原理,80,在有氧生长的条件下，原养型的工业微生物能够从葡萄糖、无机盐和水经过代谢形成整个细胞，实现生长。经胞内离心途径可以合成细胞的组成物质（见下图）。,2020/5/5,张星元：发酵原理,81,2020/5/5,张星元：发酵原理,82,在缺氧或某些特殊的条件下，胞内另一些离心途径的代谢中间物可以被脱氢酶的辅酶还原，生成一些可被分泌出细胞的能量代谢副产物，从而使辅酶得到再生，生物氧化得以继续，微生物细胞的生命活动得以维持。,2020/5/5,张星元：发酵原理,83,2020/5/5,张星元：发酵原理,84,TCA环和DCA环底物的回补显然，离心途径的运行要从中心途径抽取有机化合物。特别值得关注的是中心途径中的TCA环和DCA环，环中前提代谢物（有机化合物如TCA环中草酰乙酸和-酮戊二酸，DCA环中的磷酸烯醇式丙酮酸、丙酮酸、乙酰辅酶A和草酰乙酸等）的抽出必将影响环式运行的持续进行。,2020/5/5,张星元：发酵原理,85,若要挽回这种危局，就必须对环进行回补，以维持环中的代谢物流。以下是回补的示意图。,2020/5/5,张星元：发酵原理,86,原始底物,再生底物,2020/5/5,张星元：发酵原理,87,可把AcCoA看作是TCA环的原始底物，把OAA看作再生底物。再生底物不足，势必影响TCA环的正常运转，影响原始底物AcCoA中乙酰基的降解。因而细胞内（真核微生物的线粒体内）草酰乙酸最初的生成及其量的维持，对TCA环的正常运转至关重要。然而，草酰乙酸和-酮戊二酸是氨基酸和核苷酸生物合成所需的前体代谢物，微生物的需氧生长往往会导致再生底物草酰乙酸和-酮戊二酸等TCA环其他底物的“外流”，从而威胁到乙酰基的降解。,2020/5/5,张星元：发酵原理,88,为维持再生底物的量，必须对TCA环进行回补。回补主要来自CO2的固定和乙醛酸环（GOA环）。CO2的固定的反应包括：丙酮酸在丙酮酸羧化酶（PC）催化下的羧化：PYR+CO2OAA；PEP在PEP羧化酶（PEPC）催化下的羧化：PEP+CO2OAA；丙酮酸在苹果酸酶（ME）的催化下生成苹果酸：PYR+CO2MLA（OAA）。化能异养型微生物要在己糖或EMP途径的中间代谢物上进行需氧生长，至少需具备以上三个反应之一，以获得TCA环的再生底物。,2020/5/5,张星元：发酵原理,89,最重要的回补途径是由丙酮酸羧化酶（PC）或磷酸烯醇式羧化酶（PEPC）催化的二氧化碳固定，这个固定导致草酰乙酸的生成。丙酮酸羧化酶在ATP/ADP高比率的情况下被激活，并且受AcCoA激活、受L-天冬氨酸抑制。因此这个酶的调控几乎完全与丙酮酸脱氢酶复合物的情况相反，后者在ATP/ADP的高比率或NADH/NAD高比率的情况下受抑制，并且受高浓度的AcCoA的抑制。,2020/5/5,张星元：发酵原理,90,在酿酒酵母的细胞质和线粒体中都发现有丙酮酸羧化酶的活性。在许多原核生物中，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶是十分起作用的，但在真菌中还没被确认。这个酶受到与丙酮酸羧化酶相似的调控，也就是受L-天冬氨酸抑制并受乙酰CoA的激活。,2020/5/5,张星元：发酵原理,91,乙醛酸环可把2分子AcCoA（2C水平）转化成琥珀酸（4C水平），从而对TCA环进行回补。乙醛酸环对生长在2C底物（如乙酸或乙醇）上的细菌、真菌、藻类和原生动物来说是必须具备的代谢途径。乙酸或乙醇先转变成AcCoA，然后参与乙醛酸环代谢。,2020/5/5,张星元：发酵原理,92,乙醛酸环一共涉及到5个酶，在真核微生物中，它们都集中在一起，存在于特殊细胞器乙醛酸循环体(Glyoxysomes)中，在此细胞器中合成的琥珀酸跨膜进入线粒体中，对TCA环回补。乙醛酸环的酶受葡萄糖或其碳源营养阻遏阻遏。动物（高等动物）细胞中不存在乙醛酸环。当微生物细胞中同时有IL和MS起作用时，乙醛酸环与TCA环等同时运行。,2020/5/5,张星元：发酵原理,93,原始底物,再生底物,2020/5/5,张星元：发酵原理,94,DCA环是降解2C片断的途径，一共涉及到5个酶。可把GOA看作是原始底物，把AcCoA看作是再生底物，GOA因合成苹果酸（MLA）而进入DCA环，经发生在苹果酸（MLA）、丙酮酸（PYR）上的2次脱氢，以及发生在草酰乙酸（OAA）和PYR上的2次脱羧，最后又回复成AcCoA。,2020/5/5,张星元：发酵原理,95,GOA作为DCA环的原始底物进入DCA环，经过DCA环和电子传递链协同作用，最终被氧化成CO2和水。如果从GOA算起，每分子GOA被完全氧化生成2分子CO2、形成2分子NADH。,2020/5/5,张星元：发酵原理,96,细胞生长时，DCA环的中间产物也参与细胞组分的合成，这时DCA环也需要回补。甘油酸途径是微生物和植物利用乙醛酸（或2C碳源）生长时的回补途径。甘油酸途径之所以能向DCA环进行回补，因为甘油酸途径终端产物3-磷酸甘油酸就是EMP途径的中间代谢物，它可以经EMP途径转化成DCA环的中间代谢物磷酸烯醇式丙酮酸。,2020/5/5,张星元：发酵原理,97,分子模块等的生物合成有机物的降解途径的运行可为微生物的自身合成提供前体代谢物、代谢能和还原力。有了这三者，微生物细胞就可以合成细胞中主要的生物多聚体的前体（子模块分）：大致包括5个嘌呤和嘧啶，20个氨基酸（18个氨基酸和2个氨基酰胺），还有醣（碳水化合物）、脂肪酸（含有机酸）、维生素及其它辅助因子。,2020/5/5,张星元：发酵原理,98,这些前体再按生物学规律合成生物多聚体（biopolymers）：核酸、蛋白质、多糖和脂质等，直至整个微生物细胞活有机体。,2020/5/5,张星元：发酵原理,99,微生物的新陈代谢（包括分解代谢和合成代谢）是在特定的空间和时间进行的过程，这个过程是连续的过程，受到微生物菌种的遗传控制和微生物所处的环境条件的控制。在分解代谢（向心板块）与合成代谢（离心板块）之间存在着中心板块。中心板块上，有一些关键的中间化合物（前体代谢物），它们源自分解代谢，用于合成代谢，从而使分解代谢与合成代谢融成一体。,2020/5/5,张星元：发酵原理,100,化能异养型微生物的合成代谢具多样性和复杂性，从工业发酵的角度来看，包含初级代谢产物、能量代谢副产物、次级代谢产物、酶及微生物多糖、微生物菌体等的合成。这一节里，只是从微生物生长的角度描述微生物对单糖与多糖的合成、对含氮化合物的合成、对类脂和类异戊二烯化合物的合成，目的是大致说明构建微生物菌体细胞的路子。,2020/5/5,张星元：发酵原理,101,Glc,G-6-P,(PTS)(HK),(G6PE),R-5-P,F-6-P,F-1,6-2P,(PFK),(FDPE),DHAP,GA-3-P,3-P-GA,PEP,PYR,(PK),(PEPS)(PyPiDK),AcCoA,(PD)(PFL),(PS),糖原肌醇磷脂,肽聚糖,GlcNAc,PRPP,His,DNA,RNA,dTMPUMP,CTP,AMP,GMP,莽草酸,预苯酸,分支酸,Phe,Tyr,Trp,NAD(真菌),CoQ,对氨基苯甲酸,叶酸,磷脂甘油,Cys,Ser,Gly,-酮异戊酸,Ala,Ile,Lys能量代谢的副产物,Val,LeuCoA,续待,2020/5/5,张星元：发酵原理,102,PYR,AcCoA,OAA,MLA,SCA,ScCoA,-KG,ICA,CTA,GOA,PEP,FMA,PHB,类异戊二烯化合物,ACL-P,甾醇,脂肪酸,脂肪,磷脂,Lys(真菌),GluGlnProArg,卟啉,细胞色素,Asp,NAD,UMPCTPdTMP,ASA,Lys(细菌)Thr,Met,Ile,页上接,Asn,2020/5/5,张星元：发酵原理,103,微生物对单糖和多糖的合成化能异养型微生物细胞的多糖均可由其自身合成。微生物细胞的多糖主要存在于细胞壁、荚膜中，也有以糖原形式存在于细胞中的。微生物多糖的种类很多，这里仅对作为细菌和放线菌细胞壁的骨架结构的肽聚糖作一些说明。,2020/5/5,张星元：发酵原理,104,1单糖的合成6-磷酸葡萄糖（G-6-P）的合成化能异养型微生物合成单糖的主要途径是葡萄糖异生成途径，用于合成G-6-P的各种前体物质（如TCA环的中间代谢物和生糖氨基酸His、Gly、Ser、Glu、Arg、Asp、Thr等），均汇集到这条途径合成G-6-P。,2020/5/5,张星元：发酵原理,105,TCA环的中间代谢物用于单糖合成时先被氧化为OAA，然后OAA在PEPCK（磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶）的催化下转变为PEP，PEP借助于替代磷酸果糖激酶（PFK）的己糖二磷酸酯酶，逆EMP途径而上而合成G-6-P。,2020/5/5,张星元：发酵原理,106,一些氨基酸也可以作为合成G-6-P的前体。例如Glu和Asp分别经转氨酶转变成-KG和OAA，然后经PEP如上合成G-6-P。有些氨基酸如生酮氨基酸Leu降解后，生成AcCoA，后者经TCA和DCA联合途径合成OAA，然后合成G-6-P。脂肪酸经-氧化生成的AcCoA，也经同样途径合成G-6-P。,2020/5/5,张星元：发酵原理,107,G-6-P和6-磷酸果糖（F-6-P）、1-磷酸葡萄糖（G-1-P）这3种单磷酸己糖之间很容易通过葡萄糖磷酸变位酶（G-1-P和G-6-P之间）和磷酸己糖异构酶（G-6-P和F-6-P之间）而实现相互转换。因为这两种酶一般都过量存在，所以3种单磷酸己糖处于一种平衡状态，构成“一个不可分割的代谢（物）库”（asinglemetabolitepool）。这个代谢库可因生成3种单磷酸己糖中的任何一种而得到补充。,2020/5/5,张星元：发酵原理,108,糖核苷酸在细胞中的功能糖核苷酸是单糖的另一种激活形式，它们在细胞中主要有两种功能。一是为多糖合成提供糖基，二是为某些单糖的合成提供转换合成的机会。,2020/5/5,张星元：发酵原理,109,2多糖的合成碳水化合物存储物合成主要是以UDP-葡萄糖或1-磷酸葡萄糖为模块分子的。这个模块分子也用于大肠杆菌和其它革兰阴性菌的脂多糖层的合成，和真菌的细胞壁多糖的合成。在原核生物中作为葡萄糖基供体的糖核苷酸，在不同的合成反应中是不同的。在合成糖原时，葡萄糖的供体是ADP-Glc（而在酵母中是UDP-Glc），在其它的场合，譬如肽聚糖和脂多糖的合成中，糖的供体都是UDP-单糖。,2020/5/5,张星元：发酵原理,110,含氮化合物的合成含氮有机化合物涉及的面很广，主要包括氨基酸、蛋白质系列和嘌呤、嘧啶、核苷、核苷酸、核酸系列，还有许多辅酶（如NAD、CoA、ATP等等）也是含氮有机化合物。NH3和NH4+中氮原子的为-3价，细胞有机物中的氮原子也是-3价。工业上应用的微生物能够利用NH3和NH4+，以及糖代谢的代谢中间物合成它们所需要的全部氨基酸和其它含氮有机化合物。,2020/5/5,张星元：发酵原理,111,1、氨基酸的生物合成氨基酸是合成蛋白质的分子模块，而且作为分子模块确实是细胞最常见的20种L-氨基酸或氨基酰胺的主要功能。然而，氨基酸也可作为合成其它分子的模块分子，参与重要次生代谢产物，如青霉素生物合成。,2020/5/5,张星元：发酵原理,112,从生物合成和代谢生理的角度出发，可以将组成蛋白质的20种氨基酸及氨基酰胺分成6个族。它们分别从中心途径的不同关键中间化合物衍生出来的。,谷氨酸族天冬氨酸族组氨酸族,2020/5/5,张星元：发酵原理,113,每种氨基酸生物合成的途径可在工具书中查到。Singleton等编的DictionaryofMicrobiologyandMolecularBiology（微生物学和分子生物学辞典）一书附录部分中可查到各种代谢途径。也可以在以下网址查到：www.genome.ad.jp/keggKEGG:KyotoEncyclopaediaofGenesandGenomeswww.emblheidelberg.de/www.gmd.de/Welcome.en.htmlGermanNationalCentreforInformationTechnologyhomepage,2020/5/5,张星元：发酵原理,114,Glu和Gln在氨基酸的生物合成中处于核心地位，是其它氨基酸合成过程中最活跃的氨基供体（Ala、Asp也常作为氨基供体，其自身可直接由对应的酮酸等与氨反应生成）。因此，必须首先讨论谷氨酸和谷氨酰胺的合成问题。,2020/5/5,张星元：发酵原理,115,L-谷氨酰胺在好几种含氮化合物的生物合成中都可作为氨（氮）的供体，是整个细胞的代谢中一个重要的“分支点”，谷氨酰胺合成酶活性受多个终端产物的抑制。,2020/5/5,张星元：发酵原理,116,谷氨酰胺合成酶是受严格的调控的：它受L-谷氨酰胺的阻遏，受到许多从L-谷氨酰胺出发的合成代谢途径的终端产物（如AMP、甘氨酸和L-组氨酸）的抑制。许多生物体也可以利用硝酸盐或亚硝酸盐作为唯一的氮源，这些化合物在同化吸收前都要转化成氨。,2020/5/5,张星元：发酵原理,117,2.蛋白质的生物合成蛋白质合成中，氨基酸是原料，mRNA是蓝图，核糖体是合成机器，还需要tRNA作为氨基酸的运载工具，还需要一系列的酶和辅因子；蛋白质的合成是个消耗代谢能的过程。,2020/5/5,张星元：发酵原理,118,详细的合成过程在生物化学和分子生物学中已有叙述。这里就所合成的蛋白质的归宿做一简要说明。所合成的蛋白质定位于膜的内侧还是外侧，取决于蛋白质肽链起始端有没有“信号顺序”。,2020/5/5,张星元：发酵原理,119,这些“信号顺序”编码的肽链上含有很多疏水氨基酸，这些先合成的疏水肽链的存在，导致正在合成其本身的“核糖体串”与膜靠拢，新合成的肽链穿过膜伸到胞外；合成一结束，“信号顺序”所编码的肽链就被特殊的肽酶切下来，使新合成的蛋白质定位在膜的外侧。如果于蛋白质肽链起始端有没有“信号顺序”，新合成的蛋白质只能定位在膜的内侧。,2020/5/5,张星元：发酵原理,120,3.核苷酸的生物合成核苷酸有脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸，以及嘌呤核苷酸、嘧啶核苷酸之分，同类核苷酸还有不同的磷酸化水平之分。以核苷酸和脱氧核苷酸形式存在的核苷酸分别是RNA和DNA的分子模块，然而它们在细胞中还有许多其它功能。它们是一些含氮有机辅助因子（辅酶）比如NAD+，NADP+，FAD，CoA的主要组分。有些核苷酸，如ATP在整个细胞代谢中具有特殊功能（能量货币）。,2020/5/5,张星元：发酵原理,121,核苷酸由3个组分：一个杂环的含氮碱基（嘌呤或嘧啶）；一个糖基（RNA中的核糖、DNA中的2-脱氧核糖）；一个磷酸基团。DNA的碱基是嘌呤，腺嘌呤（A）和鸟嘌呤（G），以及嘧啶，胞嘧啶（C）和胸腺嘧啶（T）。在RNA中，存在前面三种碱基（A、G、C），但第四种碱基胸腺嘧啶（T）被尿嘧啶（U）替代。因遗传和环境条件不同，微生物可采用不同的方式进行核苷酸的合成：,2020/5/5,张星元：发酵原理,122,“从无到有”的途径：从细胞代谢的中间代谢产物，从头开始合成核苷酸分子（主要是指形成嘌呤环和嘧啶环）。“补救合成”的途径：微生物细胞生长不必样样靠自己合成。如果环境中存在嘌呤、嘧啶，细胞就可从环境中吸收嘌呤、嘧啶（或分别与它们对应的核苷），并把它们转变成核苷酸（这对微生物自身来说是经济的）；如果微生物本身不能从无到有合成核苷酸，就有必要采取补救措施，通过补救合成的途径，获得生长所需的核苷酸。,2020/5/5,张星元：发酵原理,123,各种核苷三磷酸的生物合成嘌呤核苷酸是从5-磷酸核糖和3-磷酸甘油酸（用于嘌呤生物合成）合成的，嘧啶核苷酸是从5-磷酸核糖和草酰乙酸（用于嘧啶生物合成）合成的。脱氧核苷酸可由核苷酸还原而成，通常脱氧核苷酸是通过由氢取代“2-OH”基团（氢是由NADPH提供的），在核苷二磷酸的水平上还原而形成的；只有胸苷酸例外，其脱氧核苷酸是靠脱氧尿苷酸在核苷一磷酸的水平上的嘧啶环甲基化而实现的。,2020/5/5,张星元：发酵原理,124,2020/5/5,张星元：发酵原理,125,4.RNA和DNA的合成RNA的合成（转录）可以抽象概括成：ATP,UTP,GTP,CTPRNA（含tRNA,mRNA,rRNA等）DNA的合成（翻译）可以抽象概括成：dATP,dTTP,dGTP,dCTPDNA其详细过程及反应在生物化学和分子生物学中已有叙述。,2020/5/5,张星元：发酵原理,126,5.一些含氮辅酶的合成辅酶中的有很多属于含氮有机化合物，如NAD+，NADP+，FAD，FMN，CoA，CoF（四氢叶酸、HF4），TPP（焦磷酸硫胺素）等。这些辅酶由细胞自身合成。,2020/5/5,张星元：发酵原理,127,粗糙脉孢菌、酿酒酵母像哺乳动物细胞一样，可从Trp开始，经吡啶-2,3-二羧酸合成NAD+和NADP+。Xanthomonasprum（桃李黄单胞菌）可从Trp开始合成NAD+。然而大部分已研究过的细菌合成NAD+的途径的前半段（吡啶-2,3-二羧酸以前）是完全不同的，而后半段对所有生物细胞都是一样的。,2020/5/5,张星元：发酵原理,128,6.其它含氮细胞物质的合成卟啉是构成呼吸链（或电子传递链）的电子载体细胞色素的前体。细胞色素的铁卟啉的合成从琥珀酰辅酶A（ScCoA）与甘氨酸的反应开始，经氨基乙酰丙酸而合成卟啉，最后形成铁卟啉。,2020/5/5,张星元：发酵原理,129,微生物对脂类、类脂的合成脂类是由活细胞合成的稍溶于水但溶于非极性溶剂的非均一的化合物；类脂一般是指类似脂肪或油的有机化合物。生物体的脂类和类脂的组分是多种多样的，包括酰基甘油（脂肪酸的甘油酯）、磷脂和衍生脂类（如固醇、辅酶Q、维生素A）。,2020/5/5,张星元：发酵原理,130,微生物细胞的膜结构（如质膜、间体、真核细胞的核膜、线粒体膜等）是细胞中含脂类较多的成分。微生物细胞所含的脂类主要是磷脂。多聚-羟基丁酸是原核生物最普遍的脂类贮备化合物，在较大的芽孢菌中，它又是孢子的主要贮备化合物。,2020/5/5,张星元：发酵原理,131,脂类对细胞的生命活动具有重要作用。由脂类（包括类脂）和蛋白质等组成的细胞质膜不仅对周围环境起屏障作用，而且还是物质传递的通道和新陈代谢的重要场所。脂类还常与糖类或蛋白质结合在一起形成糖脂、脂蛋白和脂多糖，它们均有特殊的生理功能。,2020/5/5,张星元：发酵原理,132,这些脂类组分的主要模块分子是脂肪酸，它存在于酰基甘油、磷脂和固醇酯中。主要的脂肪酸有：棕榈酸（C160）、棕榈油酸（C161）、硬脂酸（C180）、油酸（C181）、亚油酸（C182）和亚麻酸（C183）。在真菌中，棕榈酸、油酸和亚油酸要占75%以上，而细菌中最常见的脂肪酸为棕榈酸、棕榈油酸和油酸。组成类脂的模块分子还有-羟基酸、异戊二烯化合物等。,