JJF 1817-2020 核酸分析仪校准规范

li.di；.：，：；二组.：刊U.Klimi冒7lr霄li:l冒Im恤. 胃i理 t!, 阻E孟二二二二十吨一mW 1! 仨可Ii-m - ; 1-比wl：.， . 国1型.电 ！. ,.,_ .: 一一一中华人民共和国国家计量技术规范JJF 1817-2020 核酸分析仪校准规范Calibration Specification for Nucleic Acids Analyzers 2020-01-17发仰2020-04-17实施国家市场监督管理总局发布JJF 1817- 2020 核酸分析仪校准规范叫飞%压压町、压川、压町、压町、压町、-J . 、., . at- DAvun -,-FM- . ，4、口AUE令，“. -.- J一- . . ,-. M7口. . Ea . D8引. ,ill- . 1J、叩G咄h呻J. 、llJ剧、., . . 、., . . ，、vdJFJTH.Calibration Specification for Nucleic Acids Analyzers 归口单位：全国生物计量技术委员会主要起草单位：中国计量科学研究院凯杰企业管理上海）有限公司参加起草单位：中国农业科学院本规范委托全国生物计量技术委员会负责解释JJF 1817- 2020 本规范主要起草人：董莲华（中国计量科学研究院）高运华中国计量科学研究院）曹燕（凯杰企业管理（上海）有限公司参加起草人：隋志伟中国计量科学研究院）李亮（中国农业科学院）王晶中国计量科学研究院）JJF 1817- 2020 目录引言.II 1 范围.1 2 引用文件3 术语和计量单位. 1 4 概述. 1 5 计量特性.2 5.1 示值误差.2 52 重复性. 2 5.3 片段浓度线性. 2 6 校准条件.2 6.1 环境条件.2 6.2校准用标准物质和校准设备.2 7 校准项日和校准方法.2 7.1 示值误差.2 72 重复性. 4 7.3 浓度线性.4 8 校准结果表达.5 9 复校时间闯阳.5 附录A校准用试剂和溶液配制及使用方法.6 附录B校准原始记录参考格式.? 附录C校准证书内页参考格式.8 附录D示值误差的不确定度评定示例.9 JJF 1817- 2020 引言本规范的编制基于对核酸分析仪主要技术参数测试的基础，依据JJF1071-2010 国家计量校准规范编写规则、JJF1059. 1-2012 测量不确定度评定与表示完成本规范的制定。本规范为首次发布。II JJF 1817- 2020 核酸分析仪校准规范1 范围本规范适用于基于凝胶电泳原理对核酸片段的长度和浓度进行分析的核酸分析仪的校准，适用的核酸片段的长度范围为（1001000) bp，对于超出此片段度范围的核酸分析仪的校准，可参照本规范执行。本规范不适用于平板电泳仪和遗传分析仪的校准。2 引用文件本规范引用了下列文件：JJF 1265-2010生物计量术语及定义凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本规范：凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有修改单）适用于本规范。3 术语和计量单位3.1片段长度仕agmentlength 表示核酸片段的大小，以核昔酸数目Cnt）或碱基对数目Cbp）为单位。3.2碱基对（bp)b剖epair 核酸中两条链闯的配对碱基。如腺嗦岭胸腺H密昵CA-T）对、腺嘿日令尿u密吭CA-U）、鸟嗦岭胞略睫CG-C）对、鸟嘿岭尿R密睫CG-U）对等。碱基对数是表征DNA或双链RNA的长度。JJF 1265-2010, 4.41 4 概述核酸分析仪（以下简称分析仪）是基于凝胶电泳技术原理，将不同大小的双链核酸片段进行分离，在荧光染料存在的条件下，荧光染料嵌入双链核酸中发出荧光，对荧光信号进行检测分析的仪器，可根据各核酸片段的电泳时间和荧光信号值进行定性、定量分析。分析仪通常由进样器、毛细管微芯片、荧光检测光学部件、微电路控制部件、计算机及应用软件组成。可用于单个和多重PCRJJF 1817- 2020 片段、限制性内切酶消化的DNA等片段长度和浓度的分析。5 计量特性5.1 示值误差片段长度示值误差和片段浓度示值误差。5.2 重复性片段长度重复性和片段浓度重复性。5.3 片段浓度线性6 校准条件6.1 环境条件实验室环境应当满足分析仪安装的要求，不得存在强烈的机械振动和电磁干扰，校准时实验室温度应当控制在(1530），相对湿度不大于80%，并确保校准过程中环境温度变化小于3。6.2 校准用标准物质和校准设备6.2.1 标准物质应采用国内外有证标准物质，如DNA片段标准物质，片段浓度二三40ng/L, 相对扩展不确定度运5%Ck=2），片段长度范围ClOO1000)bp。6.2.2校准用试剂和溶液按照附录A配制校准用试剂和标准溶液。根据被校准仪器型号边择配套的试剂盒。校准用标准物质保存在20，配套试剂盒保存在4。6.2.3 移液ft量程范围（1-10）阵、（10100）此，经检定合格。7 校准项目和校准方法校准前将低温保存的标准物质及配套试剂提前拿出冰箱，平衡30min后按照附录A配制及使用标准溶液。打开仪器，预热lOmin。7.1 示值误差7.1.1 校准板的准备参照试剂盒说明书，用移液器将示值误差校准用标准溶液加入到校准板中。2 JJF 1817- 2020 若校准板为34孔的芯片模式，按照表1所示准备校准板，若校准板为12联排管模式，按照表2所示准备校准板，其他模式的校准板可参照表1和表2准备，空白用一级水代替标准溶液。表1校准板为芯片模式时的加样排布孔号样品标准标准标准l3 溶液溶液溶液标准标准标准46 溶液溶液溶液标准标准标准79 溶液溶液溶液标准空白空白1 012 溶液表2校准板为12联排管模式时的加样排布孔号2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 片断样品标准标准标准标准标准标准标准标准标准标准空白长度溶液溶液溶液i容；夜溶液1容i夜浴液溶液溶液溶液标准口仨口l 注：片断长度标准品为配套试剂盒内的长度标准阳。7.1.2 片段长度示值误差参照仪器说明书，将准备好的校准板置于分析仪内进行测量。记录10次片段长度测定值，按公式（1）计算片段长度示值误差。1!1Cbp= Cbp - Cbps 、E-A r，、式中：1!1Cbp一一片段长度示值误差，bp;cbp一一片段长度测量的算术平均值（保留整数），bp; Cbps一一片段长度标准值，bp。7.1.3 片段浓度示值误差参照仪器说明书，将准备好的校准板置于分析仪内进行测量。记录10次片段3 JJF 1817- 2020 浓度测定值，按公式（2）计算片段浓度示值误差。liCcon= Ccon - Ccons 式中：f1Ccon片段浓度示值误差，ng/L;econ片段浓度测量的算术平均值，ng/L;Ccon厂一片段浓度标准值，ng/L。7.2重复性(2) 参照7.1.1的加样方式，重复测量10次标准溶液的片段长度和片段浓度，按公式（3）分别计算相对实验标准偏差，作为片段长度重复性和片段浓度重复性。主（xi王YI RSD = I ；i x x I 00% (3) 1- J x 式中：RSD一一相对实验标准偏差，%；xi一一第i次DNA标准物质的片段浓度或片段长度测得值，ng/L或bp;X一n次片段浓度或片段长度测得值的算术平均值，ng/L或bp;n一一测量次数。7.3 浓度线性7.3.l 校准板的准备参照试剂盒说明书，用移液器将配制好的0.1ng/L、lng/L、4ng/L、IOng/L、40ng/L的DNA片段浓度线性标准溶液加入到校准板中，每个浓度加样2次，按表1或表2所示排布准备校准板，其他模式的校准板可参照表1和表2准备，空白用一级水代替标准溶液。7.3.2 片段浓度线性参照仪器说明书，将准备好的校准板置于分析仪内进行测量。每个浓度的线性标准溶液进行2次重复测量，取其浓度的算术平均值，根据标准溶液的浓度标准值为横坐标和测得的浓度平均值为纵坐标进行线性回归，按公式（4）计算线性相关系数Yo4 JJF 1817- 2020 2；以C)(C1.j一句r= 三（Ci- C)2 （Csi - CJ2 式中：y一一线性相关系数：Ci第i种线性标准溶液的浓度测量值，ng/L;C一一线性标准溶液的浓度测量值的算术平均值，ng/L;csi一一第i种线性标准溶液的浓度标准值，ng/L;cs一一线性标准溶液的浓度标准值的算术平均值，ng/L;n一一线性标准溶液的浓度个数。8 校准结果表达( 4 ) 按本规范进行校准，原始记录格式参考附录B，不确定度评定参照附录D,校准结果在校准证书上反映，校准证书应符合JJF1071-2010中5.12的要求，参照附录C给出校准项目名称、测量值以及扩展不确定度。9 复校时间间隔根据实际使用情况，送校单位可根据实际使用情况自主决定复校时间间隔，建议不超过1年。5 JJF 1817- 2020 附录A校准用试剂和溶液配制及使用方法A.1 纯水：符合GBff6682规定的一级水。A.2 标准物质：DNA片段标准物质，浓度相对扩展不确定度运5%(k=2）。A.3 三经叩基氨基叩炕CTris-HCI：分析纯。A.5 乙二胶囚乙酸CEDTA）：分析纯。A.6 TE缓冲液的配制：用分度值为O.OOOOlg的天平称量1.576g的Tris-HCl,0.292 g的EDTA，加入至IL的三角瓶内，句三角瓶内加入700mL一级水，待全部溶解后，调节pH至8.0，然后用IL的量筒定容。A.7 校准用标准溶液的配制标准溶液应现配现用。A.7.1 示值误差和重复性校准用标准溶液：用TE缓冲液将DNA片段标准物质稀释为2ng/L的标准溶液。A.7.2 线性校准用标准溶液：用TE缓冲液将DNA片段标准物质分别稀释为0.1ng/L、1ng/L、4ng/L、10ng/L、40ng/L的系列标准溶液。A.8 标准溶液的使用溶液上样量按照被校仪器说明书执行。以12联排管或8联排管模式进样的分析仪，上样量一般为15L。以12孔芯片模式进样的分析仪，每孔上样量一般为lL。6 附录B送检单位：仪器名称：型可：证书编环境温度：一一JJF 1817- 2020 校准原始记录参考格式校准日期：一一年一一另一_l3制造厂：出厂编号：相对湿度：一一%气压：一kPaB.1片段长度示值误差和片段长度重复性校准记录标准物质标准值Cbp片段长度测量值测量值的平均值相对标准偏差名称bp RSD bp cbp /bp B.2浓度示值误差和浓度重复性校准记录标准物质标准值Ccon测量值的平均值相对标准偏差名称ng/L 浓度测量值ng/LRSD C c011 / ( ng/L) B.3线性序号Sl S2 S3 S4 SS 标准值ICng/U 测量值I( ng/U 相关系数y校准贝：核验员：7 JJF 1817- 2020 附录C校准证书内页参考格式表C.1校准项目和校准结果r-t号校准项目校准结果片段长度示值误差测量值：一一一2 浓度示值误差测量值：一一一不确定度：(k=23 片段长度重复性测量值：4 浓度重复性测量值：5 线性测量值：校准员：核验员：8 JJF 1817- 2020 附录D浓度示值误差的不确定度评定示例D.l 测量方法采用分析仪直接测定DNA片段含量标准物质，并与标准物质的标称值进行比较。D.2测量模型浓度校准结果的示值误差按照公式CD.1)计算：Ccon= Cc，。”，Ccons(D.l) 式中：11Ccon浓度示值误差，ng/L;CCOll一一仪器测量平均值，ng/L:Ccons标准物质标称值，ng/L。在校准过程中环境温度波动控制在小于3C，因此忽略环境温度的影响。D.3 合成标准不确定度计算公式根据测量模型，且输入量Ceo合成标准不确定度的计算公式为：Uc= /U2百百U2Ccons D.4 不确定度来源、确定度来源包括：a）测量重复性引入的标准不确定度U-c:,; b）片段含量标准物质引入的标准不确定度Uccons;CD.2) 测量重复性和标准物质引入的不确定度不相关，所以合成标准不确定度根据公式D.2进行计算。下面以一次分析仪校准为例，具体分析其测量不确定度。在校准中对200bp 含量的标准物质测定，结果分别为2.51ng/L、2.76ng/L、2.65ng/L、2.65ng/L、2.57 ng/L、2.51ng/L、2.74ng/L、2.69ng/L、2.54ng/L、2.78ng/L：该片9 JJF 1817- 2020 段长度标准物质稀释后的标准物质稀释液的含量标准值为2.85ng/L士0.08ng/L(k=2）。D.5 标准不确定度一览表标准不确定度一览表见表D.l。D.6 标准不确定度评定D.6.1 测量重复性引入的标准不确定度u二在校准中DNA含量测定结果的值分别为2.51ng/L、2.76ng/L、2.65ng/L、2.65 ng/L、2.57ng/L、2.51ng/L、2.74ng/L、2.69ng/L、2.54ng/L、2.78ng/L: 单次测量的实验标准偏差s（乓）：三（xi）2 s(x) = / i=I 10- 1 = 0.103 ng 则测量结果平均值的标准不确定度为：Uc;:,二巾）I /;i;:; 0.103/ .j_画；：；0.033 ng/L D.6.2 标准物质引入的标准不确定度Uccons 进行含量校准时使用的是标准物质稀释液，该标准物质稀释液引入的不确定度u,cons包含了未稀释的标准物质的不确定度ucr和稀释过程引入的不确定度，未稀释的标准物质的不确定度可以根据标准物质证书提供的扩展不确定度UM,.和包含因子kc根据公式CD.3）计算：Uc U . 二一一一二一CD.3) k川川kc :i:.中：uc., 一一标