（医学课件）琼脂糖凝胶电泳

DNA/RNA的琼脂糖凝胶电泳,1,实验原理实验仪器、材料与试剂实验步骤注意事项与实验技巧,2,凝胶电泳是分离和纯化DNA片段最常用的技术；分离、鉴定和提纯核酸首选的标准方法。根据制备凝胶的材料:琼脂糖电泳凝胶电泳聚丙烯酰胺电泳,3,一、实验原理,（1）某物质在电场作用下的迁移速度叫做电泳的速率，电泳的速率与核酸分子大小和构型有关。DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。分子质量越小跑得越快，紧密构型快于松散型开环分子或线性分子，从而可以分离大小不同的DNA或RNA分子。,4,DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。,（2）琼脂糖是一种线性多糖聚合物，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。,5,采用不同浓度的凝胶可以分辨范围广泛的DNA分子。,6,含不同量琼脂糖的凝胶的分离范围,7,二、实验仪器、材料与试剂,质粒样品、酶切样品和PCR样品。凝胶电泳系统和电泳图像分析系统(凝胶成像系统)等。琼脂糖、1XTAE电泳缓冲液、溴化乙锭、6X载样缓冲液（6Xloadingbuffer）和DNA分子量标准等。,8,凝胶电泳系统,DYY-6C型双稳定时电泳仪电源（北京六一）输出范围（显示分辨率）：6-600V(1V)4-400mA(1mA)240W,美国Bio-rad伯乐小型水平电泳槽Mini-SubCellGTCell,9,凝胶成像分析系统,10,DNAMarker,一个已知分子质量的DNA样品做对照，用来确定待测样品的相对分子质量。,11,常用电泳缓冲液,12,Tris-硼酸（TBE）Tris-乙酸（TAE）Tris-磷酸（TPE）DNA的泳动受到电泳缓冲液和离子浓度的影响。缺乏离子，电导率严重降低，电泳迁移率很慢；离子强度过高，电导率升高，极易产生大量的热能，最严重的结果是凝胶熔化，DNA变性。常用的电泳缓冲液有TAE，TPE和TBE，其中TAE的缓冲容量最低，长时间电泳将被消耗。,13,上样缓冲液,电泳指示剂溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成上样缓冲液。作用：增加样品比重，以确保DNA均匀沉入加样孔内。形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置。使样品呈色，使加样操作更方便。,14,EB染料,溴化乙锭（EB）是一种高度灵敏的荧光染色剂，它在标准的302mm紫外光照射下能发射橙红色信号，当DNA样品在琼脂糖凝胶中电泳时，琼脂糖凝胶中的EB就插入DNA分子中形成荧光络合物，使DNA发射的荧光增强几十倍，电泳后就可直接紫外灯照射下检测琼脂糖中的DNA。,15,16,17,EB染料优点：染色操作简便，快速，室温下15-20min；不会使核酸断裂；灵敏度高，10ng或更少的DNA即可检出，效果较好；可以加到样品中或胶中。EB是诱变剂，有剧毒，使用时一定要戴手套，且一定要注意等到琼脂糖凉到四十多度的时候再加EB，否则EB有一定的挥发性，而鼻黏膜对EB的吸收是较明显的。EB废液要经过净化处理再行弃置。SYBR:新型低毒，高灵敏度染料，但操作不便，信号不稳定，易猝灭，价格较昂贵。Goldview:主要成分吖啶橙，高毒，在相当程度导致细胞凋忘。较便宜，但效果不及EB。,18,三、实验步骤,1.制备琼脂糖凝胶（1%）2.制备凝胶板3.加样4.电泳5.染色6.结果观察,19,二、实验方法,150TAE的稀释：如制备50mL1TAE，取1mL50TAE加入49mL水定容至50mL。2制备1%的琼脂糖胶液：取0.2g琼脂糖溶于20mLTAE中，在短时间里加热琼脂糖全部熔化，使溶液冷却至40.(加入浓度为10mg/mL的EB2L，使EB的终浓度为1g/mL)。,20,21,22,3用于RNA电泳的电泳槽用去污剂洗干净，再用水冲洗，用乙醇干燥后灌满3%的H2O2溶液，于室温放置10分钟，然后用DEPCSDW冲洗电泳槽，梳子同样处理。4用胶带封住胶床，放好梳子。,23,5将温热琼脂糖倒入胶床中，凝胶的厚度在35mm之间，凝固2060min。,24,6在凝胶完全凝固之后，小心移去梳子，将胶床放在电泳槽内，加样孔一侧靠近阴极（黑极）。7向电泳槽中注入适量的TAE缓冲液，通常缓冲液高于胶面1cm。8分别将DNA/RNA样品与加样缓冲液混合,用移液枪将样品加入加样孔。9正确连接电泳槽和电源，设定稳压为75V，电流一般为50mA。10电泳结束后，在紫外观测仪上进行观察。,25,26,27,28,四、注意事项与实验技巧,制胶和加样过程中要防止气泡的产生。紫外光对人眼有害，观察时加盖玻璃罩，观察时间不宜太长。EB具有强诱变性，可致癌。必须戴手套操作，严格注意防护。加样时，Tip头不宜插入样品孔太深，也不要穿破胶孔壁，否则样品渗漏或DNA带型不整齐。配胶和灌电泳槽需使用同一批缓冲液。因为pH或离子强度很小的差别也会在凝胶前部造成紊乱，影响DNA片段的泳动。梳板的选用一般每个制胶模具均配有多个齿型不同的梳板，梳齿宽厚，形成的点样容积较大，用于DNA片段回收实验等；相反，梳齿窄而薄，形成的点样容积就较小，用于PCR产物、酶切产物鉴定等。一般来说，上样量小时尽量选择薄的梳板制胶，此时电泳条带致密清晰，便于结果分析。,29,跑出好看的电泳图,凝胶一定要加热熔解完全，均匀，可以对着光亮的地方看看清澈不清澈；一般情况下，梳子越薄而长，条带越好看；上样量不宜过多，会造成条带的相互