IG分子PPT课件

-,1,抗体分子,-,2,抗体生物体最奇妙的分子,无限的多样性（diversity)功能与结构的双重性可变区抗原结合恒定区生物学效应功能分泌型和膜型表达,-,3,与抗体有关的诺贝尔奖获得者,-,4,本节课主要内容,一、抗体分子的基因结构和重组二、细胞工程抗体和基因工程抗体三、治疗性单抗研制进展,-,5,一、抗体分子的基因结构和重组,-,6,抗体分子结构,-,7,-,8,抗体分子片段,-,9,抗体基因基本结构,-,10,链的基因结构及重组,-,11,链的基因结构,-,12,重链的基因结构：(a)鼠(b)人,-,13,重链可变区的VDJ重组,-,14,可变区V(D)J重组机制,-,15,重组信号序列(recombinationsignalsequences,RSS),-,16,通过RSS形成茎襻状结构,-,17,12/23basepairrole(1+2turnrole),:V-1223-J:V-2312-JH:V-2312-D-1223-J,-,18,V(D)J重组的缺失机制(a)和倒转机制(b),-,19,抗体多样性的来源,-,20,2.B细胞个体发生过程中,重组时CDR3所形成的多样性(不依赖抗原）,接头处的多样性,-,21,VJ重组时接头处的变化,-,22,V(D)J重组时接头处的变化：P核苷酸和N区的形成,-,23,D基因形成的多样性,6种阅读框架D-D融合10%DIR基因7%估算:1014,-,24,3.体细胞突变:成熟B细胞经抗原刺激后产生,局限于V区的高频率随机突变亲和力成熟,-,25,受体编辑(receptorediting)和免疫耐受,Ig可变区的再次重组,-,26,再次重组,-,27,自身抗原结合诱发再次重组受体编辑克隆选择机制受体选择机制,-,28,重链恒定区的结构和重组,-,29,类别转换(classswitching),S-S重组,-,30,膜表达和可溶性表达,-,31,二、细胞工程抗体和基因工程抗体,第一代：多克隆抗血清第二代：细胞工程抗体第三代：基因工程抗体,抗体技术的发展经历了三个阶段,-,32,细胞工程抗体杂交瘤-单克隆抗体,-,33,基因工程抗体,通过基因重组改良抗体性能通过噬菌体抗体库技术研制新的抗体,-,34,小分子抗体,鼠单抗人源化,基因工程改造的抗体,-,35,小分子抗体,-,36,抗体融合蛋白,抗原结合部位与生物活性蛋白结合免疫导向免疫桥连嵌合受体含Fc段的抗体融合蛋白免疫黏附素Fc的作用：检测、纯化、延长血清中半寿期生物学效应功能,-,37,鼠单抗人源化,恒定区人源化人-鼠嵌合抗体可变区人源化人改型抗体用抗体库技术进行人源化,-,38,鼠单抗人源化,-,39,抗原表位导向选择,-,40,抗体库技术,抗体库在原核系统功能性表达多样性抗体基因(repertoire)通过多种选择手段筛选出特定性能的抗体基因,基因工程方法研制新的单抗,-,41,抗体库技术产生的三项技术基础,RT-PCR：能够克隆全套抗体可变区基因抗体基因片段在大肠杆菌的功能性表达噬菌体展示技术（phagedisplay),-,42,噬菌体抗体图示,-,43,抗体库的构建,-,44,抗体库的富集筛选,-,45,抗体库技术的应用,人源抗体的制备抗体性能的改良不经免疫制备抗体,-,46,用噬菌体抗体库技术制备人源抗体,鼠单抗人源化抗原表位导向选择（epitopeguidedselection）从免疫个体构建噬菌体抗体库进行筛选从总抗体库筛选（不经免疫制备抗体）,-,47,利用抗体库技术改良抗体性能,筛选具备特定功能或功能得到改善的未知序列改善抗体的特异性提高抗体的表达量改善ScFv接头的性能提高亲和力,-,48,亲和力成熟,低亲和力抗体,构建突变抗体库,错配PCRinvivo突变链更替CDR随机化有限性突变,动力学筛选,磁珠法液相筛选,游离抗原捕捉法,获得高亲和力变种,-,49,不经免疫制备抗体体外模拟体内的抗体生成,抗体生成三要素,多样性B细胞群体（repertiore）,克隆选择,亲和力成熟,-,50,总抗体库(masterlibrary)的构建,抗体库容量,多次构建累积,组合感染法,目前报道最大库容在109-1010,最大库容6.5X1010,-,51,组合感染法构建抗体库,-,52,构建策略,天然抗体库,半合成抗体库,全合成抗体库,-,53,半合成抗体库,体外模拟V-DJ重排,合成随机化CDR3,-,54,全合成抗体库,7个VH,7个VL,共49个子库,CDR盒式结构,-,55,几种技术路线评价,天然库：100%有功能、CDR3-H长度广泛、CDR3序列结构合理,半合成库：避免体内偏向性、可操作性,缺点：体内多样性具有偏向性,缺点：有无效克隆、CDR3-H长度受限,全合成库：尚无证实报道，据初步资料效果颇佳，构建难度大,-,56,治疗性单抗的研究进展,-,57,1.杂交瘤-单克隆抗体技术诞生2.抗独特型治疗淋巴瘤成功3.OKT3被批准上市4.单抗用于肿瘤治疗效果不佳5.抗内毒素单抗试用于败血性休克失败6.抗17-1A和ReoPro上市7.FDA批准6个单抗上市,治疗性抗体发展历程和事件,-,58,抗体名称抗体种类靶向抗原适应症批准日期OKT3鼠单抗CD3移植排斥1986Panorex鼠单抗17-1A大肠癌1995（德国）ReoPro人-鼠嵌合Fab血小板受体冠心病1994baRituxan人-鼠嵌合抗体CD20淋巴瘤1997Simulect人-鼠嵌合抗体CD25移植排斥1998Remicade人-鼠嵌合抗体TNF-炎症性肠病、1998、类风湿关节炎1999Zanapax人源化抗体CD25移植排斥1997Herceptin人源化抗体HER-2乳腺癌1998Synagis人源化抗体RSVF蛋白RSV感染1998Mylotarg人源化抗体-CD33淋巴瘤2000化疗药物交连物Campath人源化抗体CD52淋巴瘤2001,已批准上市的治疗性单抗,-,59,治疗性单抗销售概况,-,60,国外有关抗体开发的评述,正在临床试用的治疗性单抗超过上百种,1998-2000年20%研制的生物药品为单抗,10年后市场上的单抗将从现在的11个100个以上，预计销售额为$500亿,预计到2008年7个主要市场用于肿瘤的治疗性单抗的销售额达44亿美圆,-,61,进入临床治疗性单抗情况分析,治疗肿瘤：32%治疗免疫系统相关疾病：37%器官移植：11%感染：8%心血管：4%其它：6%,所治疗的疾病,-,62,所针对的抗原,/抗原数/应用数细胞膜分子：CD系列：35%42%膜受体及粘附分子：17%15%肿瘤相关抗原：10%5%细胞因子类：21%26%独特型：6%5%病毒：10%7%,-,63,人源化和人源抗体制备技术的成熟是治疗性单抗进展的关键,在目前进入临床的单抗中：60%为人源化鼠单抗20%为人源单抗20%为鼠单抗（其中70%用于肿瘤）,-,64,人源抗体研制的基本路线,人血清来源人杂交瘤单克隆抗体鼠单抗人源化噬菌体抗体库转基因小鼠,-,65,转基因小鼠制备人源抗体,灭活小鼠胚系Ig基因基因敲除JH、JK和CK基因段,将人胚系Ig基因转移到小鼠染色体微基因位点胚胎细胞注射人工染色体技术微胞介导的染色体转移,-,66,-,67,微胞介导的染色体转移,-,68,治疗性抗体的发展趋势,人源抗体制备技术已经成熟，今后将进入以人源抗体为主的时代,基因工程抗体逐渐从研究走向临床,靶向抗原的研究和选择已逐渐成为研制治疗性单抗的关键,-,69,ReubenS等人用DT40细胞系（由鸡的B淋巴细胞瘤中获取）研究，结果表明DT40细胞中AID的缺陷将导致基因转换的缺陷，检测V重排后的基因序列未发现任何一个单一的基因转换，而出现的仅有的三个单核苷酸的置换（频率为105）可能为PCR错配所致。而其中机制可能是因为对DNA的损害，造成DNA双链的断裂所致7。在上面提到的AID-BER途径中，当AP核酸内切酶切开磷酸二酯键，而这个切口未被BER及时修复，将在重排后的V区发生核苷酸置换即将假基因置换进入，有时是插入或删除某些核苷酸，则将导致基因转换。（图1）此种基因转换机制在鸡和兔是B细胞中Ig多样性产生的主要机制，但在人和小鼠中还未得到论证4。而关于基因转换的具体机制也还未清楚阐明。,-,7