血脂、脂蛋白及载脂蛋白测定

血脂、脂蛋白及载脂蛋白测定,检验教研室,一、血脂测定,血脂测定项目TC、TG、HDL-C、LDL-C、Lp（a）、ApoAI、ApoB等。检测项目的合理选择临床常规血脂测定：TC、TG、HDL-C及LDL-C这四项，有条件的实验室可测定ApoA、ApoB及Lp(a)。特殊检查项目：如Apo（A、C、C、C和E）、FFA、CETP、LPL、LCAT测定等，多用于科研或临床特殊病例研究。,血脂和脂蛋白检测前应注意的问题分析前主要影响因素有：1.生物学因素如个体间、性别、年龄和种族等。2行为因素如饮食、肥胖、吸烟、紧张、饮酒、饮咖啡和锻炼等。3临床因素如疾病继发；药物诱导4标本收集与处理,建议：1抽血前2周保持平时的饮食习惯。2抽血前3天避免高脂饮食，24小时内不饮酒，不作剧烈运动。3应在禁食1214小时后空腹抽血。4除卧床的患者外，一般应坐位休息5分钟后抽血。5抽血前最好停用影响血脂的药物数天或数周，否则应记录用药情况。,（一）血清外观分析（血清冷置试验）,（二）血清总胆固醇测定胆固醇是人体重要的脂类成分，具有重要的生理功能，如合成类固醇激素，维生素D3胆汁酸，并构成细胞膜成分，TC包括FC（1/3）和CE（2/3），胆固醇与动脉粥样硬化有密切关系，故胆固醇测定是最常用的实验室检测项目之一。TC测定方法很多，约200多种，分为化学测定法、酶法、气相色谱法、高效液相色谱法、核素稀释质谱法（决定性方法）。,1、化学测定法主要有两类（1）Liberman-Burchard反应简称L-B反应，胆固醇经冰醋酸，浓硫酸脱水生成3.5-胆烷二烯阳离子，然后被醋酐，浓硫酸氧化生成绿色的胆烷六烯磺酸。呈色稳定性差。（2）Zak反应胆固醇经冰醋酸，浓硫酸脱水生成3.5-胆烷二烯阳离子，然后在Fe3+存在下氧化生成紫红色胆烷四烯阳离子，灵敏度较L-B反应高7倍，且呈色稳定性好，但试剂腐蚀性极大，不能用于自动化分析。,2、酶法胆固醇酯胆固醇脂肪酸胆固醇O2胆烷-4-烯-3酮H2O2H2O24AAP酚红色亚胺醌H2O,CEH,ChOD,POD,试剂中除上述三种酶外，还有胆酸钠和表面活性剂及稳定剂，胆酸钠用于激活CEH，表面活性剂促进胆固醇从脂蛋白中释放。酶法操作简便，快速，试剂无腐蚀性，适合于自动化分析，但也存在有一些不足，CEH对胆固醇水解不完全，表面活性剂影响CEH活性，黄疸血清中过高的胆红素可还原H2O2使结果偏低。,【参考范围】3.105.70mmol/L【临床意义】血清TC含量受年龄、性别、饮食和运动等因素的影响。20岁以上随年龄而，70岁以后则有下降趋势。2040岁阶段男性高于女性，但女性绝经后则高于男性。城市人群高于农村人群，与饮食和运动有关。脑力劳动者高于体力劳动者。病理性高胆固醇血症原发性高胆固醇血症、糖尿病、胆道阻塞、肾病综合症、甲状腺功能减退。病理性低胆固醇血症严重贫血、甲亢、营养不良。,（三）血清甘油三脂测定TG是有一分子甘油与三分子脂肪酸组成的化合物，主要存在于VLDL和CM中，临床化学中往往以测定甘油代表TG的含量。TG的测定方法很多，如气相色谱法、高效液相色谱法、红外分光光度法。但上述方法需特殊的仪器设备和技术，故一般只用于研究工作中。临床实验室主要用化学法和酶法。,1、化学法基本步骤可归纳为四步（1）提取：甘油三脂的提取采用合适的溶剂，使脂蛋白变性提取TG，同时去除干扰物质(磷脂、游离甘油、葡萄糖等),常用方法有：1）异丙醇抽提，沸石合剂（沸石、高岭土）吸附。2）异丙醇抽提，氧化铝吸附磷脂。3）正壬烷、异丙醇、稀硫酸分溶抽提，免去吸附磷脂的操作，后用价廉的正庚烷代替正壬烷。应用较广。,（2）皂化：甘油三脂的水解一般都采用KOH乙醇或KOH异丙醇溶液，60，515min可使TG完全水解。（3）氧化：甘油的氧化最常用的氧化剂是HIO4，甘油在酸性条件下被氧化成甲醛、甲酸。反应受-磷酸甘油、葡萄糖、丝氨酸的干扰，故抽提时应尽量除去此类物质的干扰。,（4）显色：显色测定甲醛。常用方法有：1）甲醛与变色酸（4.5-二羟-2.7-萘二磺酸）在硫酸溶液中加热生成紫红色化合物。（570nm）2）甲醛与乙酰丙酮在氨的存在下缩合成黄色的3.5-二乙酰-1.4-二氢-2.6-二甲基吡啶。（420nm）,2、酶法常用的有：（1）磷酸甘油氧化酶法（GK-GPOD-POD法）TGH2O甘油FA甘油ATP3-磷酸甘油ADP3-磷酸甘油O2磷酸二羟丙酮H2O2H2O24-AAP酚红色亚胺醌H2O试剂较稳定，灵敏度高，线性范围宽，胆红素、维生素C可消耗H2O2使结果偏低。,LPL,GK,GPOD,POD,（2）乳酸脱氢酶法（GK-PK-LDH法）TGH2O甘油FA甘油ATP3-磷酸甘油ADPADP磷酸烯醇式丙酮酸ATP丙酮酸丙酮酸NADHH+乳酸NAD+（3）甘油氧化酶法第一步消除血清中原有的甘油：,LPL,GPOD,PK,LDH,游离甘油O2甘油醛H2O2,GlyOD,H2O2EMAE无色物质EMAE称N-乙基-N-（3-甲基）-N-乙酰乙二胺。是一种还原剂，灵敏度比酚高。第二步测定甘油三脂水解释放的甘油：TGH2O甘油FA甘油O2甘油醛H2O2H2O24-AAPEMAE有色化合物,POD,GlyOD,LPL,POD,【参考范围】0.561.70mmol/L【临床意义】血清TG一般随年龄增长而升高，体重超标者往往偏高。1.病理性增高原发性高脂蛋白血症、肥胖症、糖尿病、肾病综合症、脂肪肝、妊娠后期。2.病理性降低甲亢、肾上腺皮质功能减退、严重肝功能损伤。,(四)血清（浆）脂蛋白测定1、血清脂蛋白电泳临床实验室常用的支持介质有醋酸纤维薄膜和琼脂糖凝胶。（1）血清脂蛋白醋酸纤维薄膜电泳以醋酸纤维薄膜为支持介质，血清脂蛋白经电泳分离，然后用臭氧氧化，使脂蛋白中的不饱和脂肪酸的双键断裂生成醛，再用亚硫酸品红染色，即生成紫红色区带。,（2）血清脂蛋白预染琼脂糖电泳血清脂蛋白经饱和苏丹黑B预染后，以琼脂糖凝胶为支持介质，进行电泳分离，即可得到清晰的兰色区带。凝胶浓度一般为0.5%，超过1%，-Lp与pre-Lp不易分开，0.5%，凝胶机械强度太低。血清：染料为9：1，染料过多稀释标本，而且染料中乙醇会引起蛋白质变性，影响分离效果。,结果判断，直观区带的着色深浅，宽窄，用浅染，稍浅染，深染及消失加以描述；或用光密度扫描仪测定。【参考范围】-Lp30%40%pre-Lp13%25%-Lp50%60%CM（）,2、血清高密度脂蛋白测定常以测定HDL-C含量代表HDL水平。测定步骤包括HDL的分离；测定HDL中胆固醇。HDL的分离方法有：超速离心法、凝胶过滤法、免疫化学法、电泳法、沉淀法。临床实验室常用沉淀法。沉淀剂一般为二价阴离子和多价阴离子。如：肝素-Mg2+、硫酸葡聚糖-Mg2+、磷钨酸-Mg2+、聚乙二醇（PEG）等。,如：磷钨酸-Mg2+选择性地沉淀血清中的LDL和VLDL，经离心上清液中保留HDL，然后用酶法测定上清液中的胆固醇含量，即代表HDL中的胆固醇。【参考范围】男1.280.33mmol/L女1.370.33mmol/L【临床意义】HDL-C与冠心病发病呈负相关，HDL-C低于0.9mmol/L是冠心病危险因素。,3、血清高密度脂蛋白亚组分测定HDL有三个亚类（HDL1、HDL2、HDL3）最近的研究工作表明，HDL2亚类与冠心病危险度的相关程度比总HDL-C更密切。HDL2d=1.0631.125g/mlHDL3d=1.1251.210g/mlHDL2脂类60%蛋白质40%；HDL3脂类45%蛋白质55%,高密度脂蛋白亚组分的分析方法有超速离心法、柱层析法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法、多价阴离子分级沉淀法。其中多价阴离子分级沉淀法具有快速、经济、简便更为实用，是目前临床实验室最常用的方法。常用的沉淀剂有硫酸葡聚糖-Mg2+、聚乙二醇（PEG）。,【原理】用PEG做沉淀剂，以不同浓度的PEG在不同pH条件下分别将VLDL和LDL（沉淀剂95g/LPEG，pH6.5）HDL2（沉淀剂170g/LPEG，pH7.5）沉淀，上清液中只含有HDL（沉淀剂）和HDL3（沉淀剂），然后用酶法测定HDL-C和HDL3-C，并以HDL-C减去HDL3-C的差即为HDL2-C的含量。【参考范围】HDL2-C男0.530.17mmol/L女0.620.22mmol/LHDL3-C男0.750.17mmol/L女0.750.16mmol/L,4、低密度脂蛋白测定低密度脂蛋白水平通常以LDL-C含量表示。LDL-C测定方法很多，常用的有：（1）Friedewald公式法LDL-CTCHDL-C或在一般情况下能得到可被临床接受的近似结果，但TG4.25mmol/L时不能应用此公式计算，否则结果偏差太大。,mg/dl,mmol/L,（2）聚乙烯硫酸盐沉淀法聚乙烯硫酸（PVS）能选择性沉淀血清中LDL，再以血清TC减去上清液（含HDL和VLDL）胆固醇，即得LDL-C值。试剂中加入EDTA去除两价阳离子，避免VLDL共沉，辅以聚乙二醇独甲醚（PEGME）可加速沉淀。（3）直接测定法匀相的LDL-C直接测定法是以不同的表面活性剂的双试剂使非LDL-C与LDL-C分两步水解，因先消除非LDL-C，故也称为消除法。,【参考范围】LDL-C3.12mmol/L【临床意义】LDL-C增高是动脉粥样硬化发生发展的主要危险因素。,5、脂蛋白（a）测定脂蛋白(a)是由载脂蛋白(a)与载脂蛋白B100通过二硫键连接所形成的特殊蛋白。脂蛋白(a)测定的方法目前常用的是ELISA法。血清中的脂蛋白(a)与单克隆抗Lp(a)抗体结合，再与过氧化物酶结合，形成Lp(a)-单克隆抗体-酶复合物，然后与底物孵育显色。,【参考范围】120180mg/L【临床意义】Lp（a）动脉粥样硬化、冠心病的独立危险因素，与动脉粥样硬化成正相关。血清Lp（a）浓度300mg/L时，其冠心病的发病率高于健康人的25倍。血清Lp（a）水平主要决定于遗传，个体间Lp（a）水平差异很大，但同一个体血浆Lp（a）水平的变化较小，环境、饮食、药物对它的影响不明显。,（五）血清载脂蛋白A及B测定脂蛋白中的蛋白质部分称为载脂蛋白（apolipoprotein，Apo），可分为A、B、C、D、E、F、G、H八类，其中ApoA，B，C还有亚类。ApoA是HDL的主要蛋白质，占HDL蛋白质的85%左右，它的血清浓度可代表HDL水平，ApoB是LDL的主要蛋白质，占LDL蛋白质的97%左右，ApoB浓度主要反映LDL水平。,Apo的测定方法主要有三类：层析分离，然后再按一般蛋白质定量；电泳分离后经染色光密度扫描定量；各种免疫分析法。层析法操作麻烦，一般只用于研究；电