HPLC常见故障排除及维护

HPLC常见故障排除与维护,第一部分：,色谱仪常见故障分析及排除,LC-100液相系统示意图,确定故障现象,用排除法寻找问题原因,分析可能引起问题的因素,用基准的方法验证系统,从简单问题入手,色谱故障排除步骤,寻求帮助,一次只变化一个因素，以使你能够确认所变因素与问题之间的关联。,养成良好的记录习惯。将来利用记录可以帮助发现问题，强化预防保养工作。,尝试预测将来可能发生的问题。利用成功的故障排除经验。,恢复原状。如果使用更换组件的方法来查找问题之所在，完毕后应将原有完好组件安装回原处。否则，换下来的组件将来很难再利用，造成浪费。,确认问题至少发生两次以上。如果问题不重复出现，很难证实其确实存在。,色谱故障排除经验规则,引起HPLC发生问题的潜在因素,HPLC常见故障因素,环境电源接地线温度湿度清洁程度,化学品色谱柱保护柱溶剂样品,仪器泵进样器检测器数据处理单元,HPLC常见故障因素（工作环境）,电源容量、稳定性地线系统统一电源,统一接地湿度对光学部件的影响尤为严重温度空调机的影响清洁不要轻视灰尘的影响,工作环境的影响,HPLC常见故障因素（化学品）,已损坏的保护柱、色谱柱所用溶剂、试剂的品质化学品使用不当带来的影响样品前处理方法不当带来的影响实验前的准备和结束后的收尾工作,化学品的影响,友情提示：保持良好的色谱柱使用习惯,友情警示：使用缓冲液的注意事项,缓冲液可以提供离子平衡的反离子，并使流动相保持一定的离子强度和pH值，减少拖尾。但是使用缓冲液要注意几点：1、避免使用盐酸盐，盐酸盐对钢质有腐蚀作用。2、缓冲液最好要现配现用，往往缓冲液是良好的菌类培养液，隔天或放置长时间实验时会有很多怪现象发生。3、实验后不可用有机溶剂直接过度，有机溶剂会处使盐类析出，造成液路或色谱柱堵塞，可用95：5的水甲醇冲洗。4、使用缓冲液要及时掌握pH范围，做到胸中有数。5、清洗液路和柱子时，有温控可加热到30摄氏度易于冲洗。6、长时间用缓冲溶液要注意观察接头处有无析出，若有白色盐类析出，可考虑一定周期用10%硝酸冲洗一下液路（拆下柱子，走30ml,再用5倍水冲洗）可以避免液路的堵塞。7、选择缓冲液要用可靠的试剂，避免不纯的盐类造成不必要的麻烦。,HPLC常见故障因素（泵）,LC-P100高压恒流泵,HPLC常见故障因素（泵）,正确使用您的色谱泵：,使用高品质的溶剂溶剂过滤（注意滤膜的选择）脱气溶剂柱塞杆清洗注意调节流量时的变化速度,HPLC常见故障因素（泵）,注意流动相组分的互溶性！使用正确的密封圈清洗溶剂！,泵头,泵腔体,吸入阀导通,活塞向后运动,泵座,宝石活塞杆,密封圈,排出阀关闭,液流方向,泵的工作原理：吸液过程,泵头,泵腔体,吸入阀关闭,活塞向前运动,泵座,宝石活塞杆,密封圈,排出阀导通,液流方向,泵的工作原理：排液过程,HPLC常见故障因素（泵头）,柱塞杆,密封圈,HPLC常见故障因素（泵头）,出口单向阀,进口单向阀,泵头,泵头,吸入阀宝石球与球坐粘连，吸入阀不能导通,活塞向后运动,泵座,排出阀关闭,液流方向,泵吸液过程有故障情况：吸入阀宝石球粘连,泵腔体内没有液体流入,宝石活塞杆,密封圈,排出阀导通,泵座,宝石活塞杆,密封圈,吸入阀宝石球与球座之间有杂质，液体反向泄漏,液流方向,泵排液过程有故障情况：宝石球与球座之间有杂质,反向泄漏液流方向,反向漏液方向,活塞向前运动,HPLC常见故障因素（单向阀）,出口阀,进口阀,宝石球不能向上运动,液流方向（正向）,无液流流出,宝石球与球座粘连不能向上运动,使正向流动的液流,宝石球与球坐粘连,单向阀有故障情况：,不能通过,接触面处有杂质,宝石球与球座之间,宝石球与球座不能,形成了液体的反向,宝石球与球座之间有杂质,单向阀有故障情况：,液流方向（反向）,紧密接触,有杂质,泄漏,如何减少单向阀的故障,流动相一定要用0.45m的滤膜过滤。避免使泵长期不工作，使流动相干枯。避免使用高粘度的流动相。使用带缓冲盐的流动相后，一定要充分清洗。定期对流动相过滤头进行清洗。,吸入单向阀故障的排除,单向阀的故障现象，极大多数出现在吸入单向阀上。可以将吸入单向阀从泵头上拆下，接上专用针头，用蒸馏水冲洗即可（冲水时注意手指要按住吸入阀头部白色垫圈，防止内部零件冲出）。,泵头,吸入阀关闭,泵座,宝石活塞杆,密封圈,排出阀导通,液流方向（压力下降）,密封圈泄漏产生的故障现象：,密封圈与宝石杆之间存在间隙，导致漏液和压力下降,泵腔体,活塞向前运动,如何减少密封圈的磨损,要用优质的流动相。色谱柱的压力不要太高。即不要使用受污染、老化的色谱柱。使用带缓冲盐的流动相后一定要用纯水充分清洗。避免使用高粘度的流动相。避免在没有流动相时运行泵（建议：在泵进行检测工作时设定最小压力）。,HPLC常见故障因素（泵附件）,参比阀,抽液阀,右泵头,左泵头,压力传感器,废液,溶剂过滤头,HPLC常见故障因素（进样器）,7725i,HPLC常见故障因素（7725i）,PN:201000119,HPLC常见故障因素（7725i）,进样请选用型号正确并完好的注射器,HPLC常见故障因素（7725i）,请正确安装手动进样器！,X,HPLC常见故障因素（7725i）,请选择正确的转子类型！,详情请参考Rheodyne公司网站：,HPLC常见故障因素（检测器）,LC-UV100紫外检测器,废液输出,流动相输入,高压恒流泵,色谱柱,高压恒流输出,液晶显示器,键盘,主机板,串行接口板,USB接口,RS232接口,RS485接口,样品注入,氘灯电源,氘灯,透镜,反光镜组件,流通池,光敏二极管与前置放大器,样品输出,紫外检测器,进样器,定量环,光栅,模拟信号输出,HPLC常见故障因素（检测器）,氘灯启动失败解决：检查电源检查氘灯使用时间,波长校验失败解决：清洗检测池,错误信息,HPLC常见故障因素（检测器）,错误信息：,机内时钟电路的位置,原因：电池耗尽或电路损坏,解决：更换机内12887时钟电路重新校正仪器,注意：关闭并断开电源防止静电损伤,日期时间显示错误,HPLC常见故障因素（检测器）,注意：关闭并断开电源防止静电损伤,检测器更换氘灯,氘灯,HPLC常见故障因素（检测器）,检测器使用和维护的其它注意事项,不要挡住检测器散热风扇和通风孔不要随意更改检测器进、出口管路长时间停用检测器时，应在检测池中充满甲醇或乙腈，必要时密封检测器进、出口管路,HPLC常见故障因素（色谱柱连接）,优质,劣质,PEEK接头PN:PSL613315,X,X,性能维护套件介绍,性能维护套件,LC-P100泵单向阀,性能维护套件介绍,流通池体积:8L光程:8mm,LC-UV100紫外检测器流通池,性能维护套件介绍,性能维护套件,UV检测器氘灯,请使用正品部件,正品密封圈,非正品密封圈,第二部分：,色谱柱常见故障诊断及维护,1.常见问题基线噪音,可能的原因：,流动池脏,检测器灯有问题,如果是周期性的，则起源于泵的脉冲,温度对检测器的影响,气泡经过检测器,基线漂移,梯度洗脱温度不稳定(示差检测器）流动相中有污染物柱中的流动相没有平衡体系中有污染物流出,可能的原因：,鬼峰,鬼峰即使不进样也会出现的峰,20%-100%MeOH,没有进样,3,7,15,17,问题1-流动相脏问题2-样品过量(也可能是回收率太差),峰型,双峰,柱塌陷,柱中有死体积,过滤片部分堵塞,只有一个双峰组分的共洗脱,可能原因：,样品与溶剂不匹配,峰型,所有的峰都展宽,柱效降低柱死体积,大进样量/质量,高粘度流动相,部分峰展宽,前次进样后流出的组分,大分子量样品蛋白或聚合物,样品与流动相不匹配,峰型,原因：,部分峰拖尾,二次保留效应残留硅醇基的反应,小峰紧跟在大峰的后面流出,柱头有污染,金属,所有峰拖尾,额外的柱效应,柱损坏,不适当的样品量/溶剂,峰型,峰型,原因样品的吸收比流动相的吸收值低当样品组分通过色谱柱时打破了原来的平衡用示差检测器时是正常的,宽峰,柱外体积增加,*在进样口到柱或柱到检测器之间，使用细的短的连接管*保证所有的管路接头都使用正确*用小体积检测池*减少进样量,柱外体积效应的影响,1.不进样时柱压连续升高-泵密封垫-流动相有颗粒-流动相溶解性-流动相的不稳定性(聚合)-形成柱死体积(与使用条件有关)2.进样时压力升高-样品有颗粒-样品在流动相中不溶-样品组分与固定相不兼容,压力,1.所有峰都向低保留值方向漂移（酸、碱、中性化合物）-键合相流失-流动相不稳定(可能性较小)-溶剂输送系统(流速变化)2.所有峰都向高保留值方向漂移-在水/有机溶剂的混合体系中，有机溶剂含量减少-柱改变(可能性较小)-溶剂输送系统(流速变化)3.离子型化合物的色谱峰的保留值漂移-流动相中挥发性组分损失(离子强度,pH漂移)-柱改变(键合相或污染),保留值漂移,1.与流动相有关的问题-使用新鲜的流动相pH电导色谱性能测试2.与色谱柱有关的问题-测试新柱-用标准的测试混合样测试新柱-“清洗”色谱柱后再测-考虑样品基质与使用条件对柱稳定性的影响,保留值漂移,良好的柱使用规范,预柱与保护柱,从泵来的流动相,预柱,进样器,保护柱,分析柱,到检测器,预柱对流动相而言,保护柱对色谱柱而言,StrippingorConcentratingColumn,AuthoringDivisionNameFileNameSecurityNotice(ifrequired),H,带可重复使用接头及完整保护柱的卡套柱,无保护柱,有保护柱,带Techtron保护柱的Zorbax卡套柱,带整体过滤片的Techtron保护柱,制备样品:流动相,过滤样品，以确保其不含有固体微粒,用流动相或比流动相极性较弱的溶剂溶解样品,进样的样品体积应尽量小,样品不溶于流动相,真正的环境样品样品的溶解性溶剂强度体积效应Contaminant微粒强保留的组分,色谱柱维修/再生物理阻塞,在安装柱前后测试压力差如果柱压力太高，反装色谱柱，并用10-20倍柱体积的流动相冲洗色谱柱，监测压力变化若出现沉淀(如：蛋白凝聚、细胞物、聚合物)设法用相应的可溶性溶剂，如0.1%TFA/80%乙腈,6M盐酸胍,THF,HFIP若仍无效，应考虑更换过滤片,ColumnInletFrit,CompressionFerrule,ColumnBody,FemaleEndFitting,MaleEndFitting,色谱柱故障诊断与排除更换柱头过滤片,带手套填料不能变干不要接触色谱柱体加热填料会被挤出不要拧的过紧,色谱柱修复和再生化学变化-1,由于键合相的水解或硅胶的溶解而造成的色谱柱填料的变化是不可逆的由于污染而产生的色谱柱变化可以通过适当的清洗使之修复梯度洗脱的方式(水-强有机溶剂)通常最有效低pH流动相,如0.1%TFAor0.01MH3PO4,也是有效的升高温度（60-80）,6M盐酸胍、异硫氰酸胍、尿素等溶液可用于清除蛋白质的沉积。XDB,有机聚合物等填料可使用高pH水溶液/有机溶液，如：0.01MNaOH50%异丙醇/水溶液，硅胶基质应尽量减少接触时间(15-30min)。,色谱柱的修复和再生化学变化-2,Example:4.6mmIDx15cmZorbax300SB-C18Flowrate:1mL/min;Temp:80A:0.1%TFAinwaterB:0.1%TFAinacetonitrile100%Afor30min.;0-100%Bover30min.;Hold100%Bfor30min.,Returnto100%Ain5min.Repeat3times.,总结,如果使用时加以注意，大部分的液相色谱柱的问题是可以预防的-流动相必须是互溶的，无颗粒-使用保护柱和在线过滤器，并定期更换-使用恰当的样品制备方法-使用恰当的色谱柱清洗程序-不同类型的色谱柱，请选择不同的操作条件(如：SB:pH1-6,XDB:pH3-11)-保存柱反压及重要的色谱参数的记录(如：R,N,As,k)-色谱柱需保存在有机溶剂中(乙腈),关于保留时间漂移的专题讨论,保留时间不重现,保留时间不重现有两种不同的情况：1、保留时间漂移：保留时间仅沿单方向发生变化。2、保留时间波动：保留时间无固定规律的波动。,保留时间不重现的原因分析,将上述两种情况区分开来对找到问题的原因往往很有帮助。保留时间的漂移往往由柱老化引起；而柱老化不可能引起保留时间的无规律波动。事实上，保留时间漂移的多半原因是不同机理的色谱柱老化，如固定相流失（例如通过水解），色谱柱污染（由样品或流动相所致）等。,保留时间不重现的因素,保留时间漂移的几种最常见的原因如下：一、色谱柱的平衡二、固定相稳定性三、色谱柱污染四、流动相的组成五、疏水坍塌,保留时间不重现的因素与排除,一、色谱柱的平衡如果我们观察到保留时间漂移，首先应考虑色谱柱是否已用流动相完全平衡。通常平衡需要10-20个柱体积的流动相，但如果在流动相中加入少量添加剂（如离子对试剂）则需要相当长的时间来平衡色谱柱。流动相污染也可能是原因之一。溶于流动相中的少量污染物可能慢慢富集到色谱柱上，从而造成保留时间的漂移。应注意：水是很容易污染的流动相成分。,保留时间不重现的因素与排除,二、固定相稳定性固定相的稳定性都是有限的，即使在推荐的pH范围内使用，固定相也会慢慢水解。例：硅胶基质在pH4时水解稳定性最好。水解速度与流动相类型和配体有关。双官能团配体和三官能团配体比单官能团配体的键合相要稳定；长链键合相要比短链键合相稳定；烷基键合相比氰基键合相稳定的多。如经常清洗色谱柱会加速色谱柱固定相的水解。其他硅胶基质键合相在水溶液环境中也可以发生水解，如氨基键合相等。,保留时间不重现的因素与排除,三、色谱柱污染保留时间漂移的另一个常见原因是色谱柱污染。HPLC色谱柱是非常有效的吸附性过滤器，它可以过滤并吸附流动相携带的任何物质。污染源可以是：流动相本身，流动相容器，连接管、泵、进样器、仪器密封垫以及样品等。通常通过实验可判断污染的来源。样品中如果存在色谱柱上保留很强的组分，就可能是使保留时间漂移的潜在根源。这些根源通常是样品基质。如：配药中的赋形剂，生化样品（如血清）中的蛋白及类脂类化