药用植物Lippiasidoides的内生真菌

药用植物立比草的内生真菌及其抗药性研究,李洋吴凯罗微张俊高平安,摘要EndophyticfungiwereisolatedfromhealthytissuesofLippiasidoidesCham.(Verbenaceae),from480fragmentsofleaves(240)andstems(240),atotalof203endophyticfungiwereisolated,representing14speciesbelongingtothegroupsAscomycota,CoelomycetesandHyphomycetes.Endophyticcolonizationwasgreaterinleaves(50.4%)thaninstems(35.4%).Colletotrichumgloeosporiodeshadthemaximumcolonizationfrequency(12.3%),followedbyAlternariaalternata(7.08%),Guignardiabidwelli(6.87%)andPhomopsisarcheri(5.41%).内生真菌是从健康的利比草（马鞭草科）中分离。（240个叶子组织，240个茎段，总共480个组织中分离出203个真菌）真菌从属于14个菌种，其中子囊菌，腔胞菌，以及丝孢菌。炭疽菌是分布最大的真菌（12.3%），接下来是交链格孢（7.08%），葡萄球黑腐病（6.87%），阿切尔拟茎点霉菌（5.41%）,Somespeciesshowedspecificityforthehosttissue:Curvulariapallescens,Dreschleradematioidea,G.bidwellii,Microascusdesmosporum,Peacilomycesvariotti,PericoniabyssoidesandUlocladiumoudemansiiwereonlyisolatedfromleaveswhileFusariumlateritiumandPhomatracheiphilawereonlyisolatedfromstems.Throughapreliminaryscreeningandfermentationassay,16isolateswherefoundtoproduceantimicrobialmetabolitesagainstbacterialandfungi.Thediversityandroleofendophytesinmedicinalplantsisbrieflydiscussed.Inconclusion,endophyticfungifromL.sidoideshavepharmaceuticalpotentialandcanbeseenasanattractivesourceofbiologicallyactivecompounds.一些菌种在寄主植物中表现出独特的分布特点：苍白弯孢霉，Dreschleradematioidea，葡萄球黑腐病菌，Microascusdesmosporum,拟青霉，黑团孢，奥德曼细基格孢只能从叶子中分离，而砖红镰孢霉，桔茎点霉只能从茎中分离，通过初步筛选以及发酵产物分析，16种分离的真菌发现产生抗菌性代谢产物来抑制细菌和真菌，在药用植物中内生真菌的差异以及作用进行了简短的讨论。总之，从立比草中分离的内生真菌在药物学上有很大的潜力，可以被看做颇具吸引了的生物活性化合物,立比草的药用特性,立比草属于南美，中美和非洲生长的马鞭草科，有大约200种不同的种类。它产生的香精油含有高含量的成分麝香和香芹酚。许多药理学家测试确认它可作为传统药物来治疗感染性疾病。它的叶子和花制成的茶叶能够作为防腐剂治疗刀伤和烧伤的抗感染药物,内生真菌与寄生植物的关系,寄主植物健康组织和细胞内的内生真菌一般不引起任何明显的疾病症状，他们能够建立起一种共生的关系，研究表明内生真菌给他们的寄主提供一些利益，比如帮助他们抵抗有害昆虫，病原体甚至家禽。因此，植物的药物学特性可能来自于其产生的具有生物活性的次级代谢产物。这些产物可能是极其罕见的重要的有机物。因此内生真菌被视为对农业，工业，医药领域新的有用的天然的具有活性的产品的重要来源。,研究目的,分离内生真菌确定各真菌的分布频率评价他们产生的抗菌化合物的潜力,实验过程,一.真菌分布率的计算立比草植物材料表面进行消毒及灭菌。茎和叶在流动的水龙头下冲洗，70%酒精下浸泡1min，NaClO浸泡4min，再在70%乙醇中浸泡30S，最后用灭菌的蒸馏水洗3次。通过取最后一滴的冲洗水滴到含有TSA皮氏培养基中来确定灭菌效率。（为什么用这种培养基）表面消毒后，将样品叶子切成0.5cm，茎切成,0.5的碎片，在无菌条件下转接到含SAB的皮氏培养基（添加了四环素100g/mL和氯霉素100g/mL来抑制杂菌生长）中。（为什么用这种培养基）30培养30天。每天进行观察，将所有出现的真菌都进行分离后，再培养在PDA上供进一步鉴定，真菌的分布频率考虑了分离得到的菌株Ni数和总的细菌数Nf。（为什么用这种培养基，怎样将所有真菌分离，如何准确确定分离真菌）FC%=Ni/Nf100%,注释（查找个培养基的作用）,SAB培养基=沙氏琼脂培养基组成（g/L蛋白胨10；葡萄糖10；琼脂15；pH5.6）PDA培养基=马铃薯葡萄糖琼脂培养基组成（g/L马铃薯200；葡萄糖20；琼脂15；pH6.0）TSA培养基=大豆酪蛋白琼脂培养基组成（g/L蛋白胨5；胰蛋白胨5；次氯酸钠15；琼脂15；pH5.6）,二.内生真菌的鉴定利用菌落的宏观特性（颜色，外观，黏度，和色素沉淀）以及他们的微观特性（植物形态和生物结构），在鉴定时，待鉴定的真菌需要先在PDA,SAB和液体培养基在282下培养30天。,三.目标微生物（为什么用这些菌）作为本次实验抗菌活性目标微生物的细菌是金黄色葡萄球菌，枯草杆菌，大肠杆菌，肺炎杆菌，铜绿假单胞菌，真菌则是白色念珠菌，糠秕马拉色霉菌，深红毛癣菌,四.抗菌活性的筛选每种真菌在PDA皮氏培养基表面30下培养7天，平板上用被火烧热后的塞子钻孔（直径6）取菌落并转移到预先铺有细菌，白色念珠菌和深红毛癣菌及糠秕马拉色菌的0.5%橄榄油的SAB培养基上。接有细菌的皮氏培养皿在37下培养24h，真菌在30下培养48h，通过可视法检测抑制环来确认抗菌活性。,五，发酵产物检测利用扩散分析对上面筛选显示生长最好的菌株进行进一步检测。通过生长着培养菌的5个塞子（直径6）和50mlPDB烧瓶来准备预接种菌。所有的培养物都在282，转速为180r/min的摇床上培养。将10ml的培养物分别转接到90mlPDA，ME，EPM的500ml烧瓶中，烧瓶在同样条件下培养96h,每隔24h,将1ml的发酵液在225g下离心15min。利用培养皿扩散法测定30L浮在上面的物质抗菌活性。,注释,PDB马铃薯葡萄糖肉汤组成（g/L马铃薯200，葡萄糖20；pH6.0）ME麦芽浸膏汤组成（g/L麦芽提取物20）EMP（eurimycinproductionmedium）泛霉素培养基组成（g/L大豆粉20；葡萄糖20,；碳酸钙2；氯化钠5）,实验结果和讨论,表面灭菌的效率是通过微生物在接种30天后增加的减少量来确定，从植物组织中真菌的产物是在48h后被首次发现的真菌的分布特性总共203种分离的内生真菌是从被分析的480块植物碎片中分离的（240片叶子和240块茎碎片），分布率为42.29%。,在叶片和茎块中真菌群落中有所不同。其中121种（50.41%）真菌从叶片中获得，83种（41.2%）从茎块中获得这些被分离的菌种能够被确认从属于下列14种菌种属于子囊菌，腔胞菌，以及丝孢菌，炭疽菌是被分离出来频率最大的菌种（12.3%），接下来是交链格孢（7.08%），葡萄球黑腐菌（6.87%），阿切尔拟茎点霉菌（5.41%）这些分离的菌中显示是没有生殖结构的则属于无孢菌类，,立比草组织中分离的内生真菌的数目及其比例,空格表示没有真菌,一些核心的内生菌种比如交链菌，炭疽菌，拟茎点霉，以及球座菌总是从任意给定的寄主中分离出来以外，还有一系列次要的菌种均能每次在数百个样品中被分发现一到两次。包括细极链格孢念珠菌，棒孢霉，苍白弯孢霉，多变拟毒霉，亚麻色黑团孢霉以及奥德曼细单格孢这些只能从小部分样品中被分离出来。通常稀有的和次要的真菌菌种分离的数目与取样的次数有关。,分生聚集体趋向于分布在特定的组织中，例如葡萄球黑腐病菌仅能从立比草的叶子中获得，桔茎点霉仅能从茎中获得，以及炭疽菌和交链格孢能从叶和茎中获得。不同植物组织就像分开的小环境，甚至一种植物相关的习性是一种动态的环境。这些植物寄主与内生真菌以及致病微生物相联系，寄主植物的年龄，生长海拔以及生长方位都能够影响内生真菌聚集体以及菌群出现的频率。,真菌抗菌性分析所有从立比草中分离的真菌都被提取出来在固体培养基上进行了抗菌性分析。（一）203种内生真菌中有16种真菌在培养基上对目标微生物产生了从12到30mm不等的抑菌圈。,从叶子上分离的虽然只有一小部分菌种，但是有较广的活性光谱，以及抑制革兰氏阳性菌和阴性菌的能力。这可以来解释传统药物中利用立比草叶子来简要治疗细菌和真菌感染的传染性疾病。活性光谱,（二）从立比草叶片中提取的香精油以高含量的百里香酚和香芹酚而著名。这些物质显示出很强的抗药活性。特别是对于扛细菌和真菌的医学重要性。可杀灭的菌种如下假丝酵母和狗小孢霉。传染性皮肤病生龋齿的链球菌和白色念珠菌酵母二斑叶螨，二斑叶螨是世界上比较严重的大棚蔬菜害虫。埃及伊蚊的幼虫,内生真菌的有抗菌活性的菌被限制在四种菌：交链格菌(9)，阿切尔拟茎点霉（2），D.dematioidea(2)，炭疽菌（11），还有另外两种类型显示出生物活性，但是不能产生生殖结构因此被称为无孢菌丝类（2）（括号里的数字表明每种表现出对于生物抗性活性的菌的数目）,通过发酵液中内生真菌在预先接种的培养基上抑菌圈的大小来测定它们抗菌活性,通过发酵液中内生真菌在预先接种的培养基上抑菌圈的大小来测定它们抗菌活性,注释,nt=nottested;-=无活性；SA=金黄色葡萄球菌;BS=枯草杆菌;KP=肺炎杆菌;MF=糠秕马拉色菌;TR=深红毛癣菌,将16种内生真菌发酵产物进行进一步分析。10种表现出抗微生物活性，他们中90%表现出对于金黄色葡萄球菌的抗性，30%对枯草杆菌有抗性，10%对肺炎杆菌有抗性。这些抑菌圈的直径范围在13mm到25mm之间。但是没有内生真菌表现出对于糠秕马拉色菌和深红毛癣菌的抗菌活性。,在发酵产物鉴定中的参数：像PH,生产时间，和培养基组成进行分析表明麦芽浸膏汤（ME）（7296h)以及ph57是对于微生物产活性化合物最好的培养条件。这些培养条件，搅动以及温度能够增加或减少真菌发酵的产的具有生物活性化合物的产量。培养温度，培养基组成，以及通气量也会影响内生真菌产化合物的数目，组成。因此，更加深入的检测需要去评估这些菌种的生物活性。,延伸研究在另外一些药性植物的研究中，交链格孢，交链孢霉，炭疽菌和拟茎点霉也被分离出来，并且发现他们对于细菌金黄色葡萄球菌，耐甲氧西林金葡萄球菌，大肠杆菌和苦草杆菌具有抗性。还有从蒙古蒿茎内分离的胶孢炭疽菌作为一种内生菌，它产生的一种抗菌代谢物被称为炭疽酸，能抑制枯草杆菌，金黄色葡萄球菌，以及植物性病源真菌麦根腐长蠕孢。,拟茎点霉从药用植物鸡冠刺桐中分离，产生的抗生素命名为phomol,它表现出抗真菌，抗细菌和较弱的细胞毒素的活性不形成孢子孢子的真菌菌丝体是从药用植物喜树中分离的，这是一种重要的生物活性物质来抑制金黄色葡萄球菌，枯草杆菌，大肠杆菌，白色念珠菌。,内生真菌的天然产物能够抑制或杀死大量有害的微生物，包括植物致病菌，细菌，真菌，病毒，和影响动物和人的原生动物。但是在体外培养时，这些菌种能够表