动物试验前的准备和动物试验质量监控.ppt

实验动物的选择原则和应用,上海中医药大学实验动物中心中国生物医药技术服务中心汤家铭,初次准备做动物实验的困惑,动物种类、品种、品系？动物性别？动物年龄？动物数量？动物的健康及生理状态？动物的价格？动物的饲养成本？动物能否容易得到？动物实验技术？,实验动物选择的原则是从哪里来的？,不是凭空想象出来的，而是从长期的科学研究实践中逐步积累获得的需要查阅文献，了解前人所做的工作用什么动物做实验是多种因素综合、权衡的结果，原则并不是僵死的仔细考虑动物实验所要达到的目的、现行的实验条件、技术及预算能否满足要求实验动物选择的原则要遵循动物实验“3R”原则,实验动物的选择原则,一、根据与人的相似性选择动物（一）选用在整体上与人在结构、功能、及进化程度相似的实验动物灵长类病原微生物的感染谱猕猴的生殖生理,猴、犬、大鼠与人在药物代谢方面的相似性,（二）选用在某些系统、器官的结构、功能与人相似的实验动物犬的血液循环、神经系统猪的皮肤结构、心血管系统蛙的反射弧实验小鼠的基因功能,（三）群体分布相似性以群体为对象的研究课题，要选择群体基因型、表现型分布与人相似的实验动物。如作药物筛选和毒性试验时，除了应考虑人类与实验动物群体在代谢类型上的差异外，通常以封闭群模拟自然群体基因型。,（四）疾病特点的相似性同一种病因/病原对不同动物（包括人）的致病作用各不相同，有的差异很大，而有的却非常相似。要寻找与人类有关疾病相似或接近的自发或诱发性疾病动物模型，选择合适的疾病动物模型进行实验研究。,（五）与人的器官脏器大小形状的相似性为临床操作打基础的动物实验，应选用与临床操作较接近的动物。如心脏移植实验、练习手术操作的动物实验，可选择猪作材料，因为猪心脏的形态大小与人很接近。绵羊每胎1-2个胎儿，体重与人胎儿相似，适合做围产期胎儿手术等实验。,二、根据解剖和生理学特点选用实验动物（一）解剖特点兔的胸腔结构兔的减压神经犬和兔的甲状旁腺大鼠无胆囊（二）生理特点犬的红绿色盲兔对致热原十分敏感犬和猫对呕吐反应敏感豚鼠易于致敏致敏比较：豚鼠兔犬小鼠猫青蛙豚鼠对维生素C缺乏敏感家兔对射线十分敏感,三、选用标准化合格的实验动物野生动物：不易获得年龄、体重一致的一批动物遗传背景不清健康状况有差异机体反应性不一致标准化实验动物排除细菌、病毒、寄生虫和潜在疾病的影响排除环境因素的影响减少实验误差，提高结果的科学性和正确性能得到国际上的承认,实验动物学的核心内容之一是实验动物的标准化，它包括实验动物的遗传学控制标准、微生物学和寄生虫学控制标准、设施环境控制标准饲料营养控制标准。实验动物标准化的意义在于在符合标准化的实验动物及其环境条件下，所做的动物实验无论在时间的先后上，还是在世界的不同实验室里，其实验结果应该具有可重复性和可对比性。,四、选择封闭群还是近交系封闭群动物的个体具有杂合性，其群体遗传特性及反应性可保持相对稳定。虽然群体对刺激的反应性有差异，在重复性和一致性上相对不如近交系好，但是在动物实验中比较接近自然种属的反应特点，因而广泛应用于教学、预实验、一般实验及药物筛选和毒理安全试验等。近交系动物由于遗传背景清楚，具有相同的基因型，表现型也一致，所以其对实验刺激反应也是一致的，实验结果正确、可靠，实验重复性好，因而广泛应用于遗传学、肿瘤学和免疫学研究上。,封闭群：品系内大部分等位基因处于杂合状态，其群体基因组成占种群基因库的一部分。,近交系：品系内几乎所有等位基因处于纯合状态，其群体基因组成完全一致，占种群基因库的一小部分。,近交系和封闭群动物遗传组成的比较,同一近交系小鼠的不同个体间的等位基因都是纯合的,同一封闭群的不同个体间的等位基因大都处在杂合状态，但群体的基因频率保持相对稳定，接近种属的自然状态,五、动物近交品系的选择不同品系代表实验动物的不同遗传基因型，因而具有不同的生物学特性，对同一刺激的反应差异很大，在选择时必须注意。研究发现，从大多数白化实验动物取得的数据，在推及人类时更接近于白人，而与有色人种的差异较大。C57BL小鼠对肾上腺皮质激素的敏感性比DBA及BALB/C小鼠高12倍。DBA小鼠对音响刺激非常敏感，闻电铃声后可出现特殊的发作性痉挛，甚至死亡，而C57BL小鼠却根本不会出现这种反应。DBA/2及C3H小鼠对同一病毒（Newcastle病毒）的反应和DBA/1小鼠完全不同，前者引起肺炎而后者引起脑炎。A系小鼠的促性腺激素含量比DBA小鼠低1.5倍。A系小鼠肝脏的葡萄糖酸活性只有C3H小鼠的十几分之一。A、C3H、津白等品系小鼠易致癌，C57、C58、津白等品系不易致癌，AKR、DBA/2、L615等品系易致白血病。C3H雌鼠乳腺癌自发率达90%，AKR小鼠白血病自发率达65%。C57BL/6J、Balb/c等为低发乳腺癌品系，而C3H乳腺癌发病率高达97%。用激素超排卵，C57BL属高排卵品系，而Balb/c属低排卵品系。,常用实验动物的寿命,六、动物年龄、体重的选择,与人性成熟期相对应的动物年龄,应根据实验目的来选择适龄动物一般实验采用生长发育期的成年动物成年实验动物体重一般为：小鼠：18-22g，大鼠：180-220g，豚鼠：350-650g，兔：2-3kg，猫：1.5-2.5kg，犬：6-15kg长期试验选用幼龄动物小鼠：15-18g，大鼠：80-100g，豚鼠：150-200g，兔：1.5-1.8kg，猫：1.0-1.5kg，犬：6-8kg。老龄动物除了用作老年医学研究外，其他学科很少应用,性成熟前后生长发育最快，而体成熟后生长发育趋缓。因此用性成熟前后动物做实验，如实验因素对动物生长发育有影响，就能很快反映出来。,ICR小鼠,SD大鼠,注意：根据年龄判断体重或根据体重判断年龄要注意品种品系的不同同批动物的年龄、体重尽可能一致，相差不应超过10%。在选择动物时，必须了解所选动物的寿命、怀孕期、哺乳期等一些指标，这些指标对保证研究工作的顺利进行及试验结果的分析是非常有用的。,七、动物性别的选择,在实验研究中如无特殊要求，一般宜选用雌雄各半，以避免由性别差异造成的误差。,八、每个试验组动物的最少数量的决定,每个试验组动物的数量反映了该组实验刺激的重复数。重复的主要作用是降低试验误差和增强代表性，提高实验结果的精确度，保证实验结果能在同一个体或不同个体中稳定地重复出来。样本数过少，实验处理效应不能充分显示，数据统计较为困难；样本数过多，又会增加成本和实际工作中的困难。因此在进行实验前必须确定最少的样本例数。,最少的样本例数可按一般估测方法确定，也可通过统计学方法进行测算确定。小动物一般单性别每组数量为10只大动物一般单性别每组数量为3只实验数据的采集每组数量可多一些，形态学观察每组数量可少一些,九、生理状态与健康情况动物的特殊生理状态如怀孕、哺乳等对实验结果影响很大。如非专门研究妊娠、哺乳等实验，应去除特殊生理状态的动物，以减少结果的个体差异。健康动物对刺激的耐受性较患病动物高。健康动物一般发育正常、体型丰满、被毛浓密有光泽且紧贴身体、眼睛明亮活泼、行动迅速、反应灵敏、食欲良好。外购的实验动物，应观察检疫1周以上，证实其身体健康后才开始实验。饥饿、衰竭、寒冷、炎热情况下，动物实验结果不稳定。应加强饲养管理，控制环境条件。,十、动物的易获得性及动物成本、饲养成本根据科研经费的预算，在宏观上估计不会影响实验结果的前提下，选择最易获得、最经济、最易饲养管理的实验动物进行实验研究。开题前应做好调查，以免在准备实施计划时，才发现无法获得所需实验动物，而十分尴尬。应该注意的是，科研中实验动物的选择是上述选择原则和科研经费预算、并结合自己实验室硬件和软件条件综合考虑、权衡利弊的结果，并应充分预计选择的实验动物对实验结果的影响。,第二节部分学科实验动物的选择和应用,一、药理学研究药理学包括药效学、一般药理学和药物代谢动力学等，除了小部分药效学研究可用离体动物实验外，一般药理学和药物代谢动力学研究离不开整体动物实验研究。大部分药效学研究要使用动物模型选择何种动物，应参考上述的实验动物选择原则和实验的具体要求进行，如对动物进行长时间多次采样，则用小动物是不合适的。为了观察不同种属动物对药物的反应性，最好同时选用两种以上动物。,二、药物安全性评价药物安全性评价是新药在上市前所必须做的一项研究，用以了解药物对各系统、器官脏器的毒性作用急性毒性试验长期毒性试验皮肤给药毒性试验皮肤给药急性毒性试验皮肤给药长期毒性试验皮肤刺激试验皮肤过敏试验遗传毒性试验生殖毒性试验致癌试验毒代动力学试验,（一）急性毒性试验急性毒性试验是通过单次或短时间内多次给药，了解动物所产生的毒性反应极其严重程度，为临床安全用药及监测提供参考。急性毒性试验一般用啮齿类小鼠。但是申报一类新药至少必须用两种动物，除了啮齿类动物外，非啮齿类最好用比格犬。小鼠一般选用昆明种、ICR或NIH等封闭群，雌雄各半，体重1822g（约45周龄），同批动物体重相差不超过4g。犬用成年犬，体重810kg。,（二）长期毒性试验长期毒性试验是通过连续反复多次给药，观察动物出现的毒性反应，剂量与毒性的关系，主要靶器官是什么，毒性反应的性质和程度以及毒性反应是否可逆等。长期毒性试验要求用两种动物。啮齿类首选大鼠；非啮齿类动物当供试品为化学品时首选比格犬，当供试品为生物药品时，要用猕猴。大鼠可选用SD或Wistar大鼠，体重要求180220g（约68周龄），体重差异应不超过平均体重的20%。试验周期在3个月以上，可选用120160g（约56周龄）。每组雌雄各半。比格犬一般用612月龄，试验前适应观察2周，必要时需要接种疫苗和驱除肠虫。猕猴采用成年猴，3-5岁（3.5-6.5kg），试验前适应观察1个月，必要时需要接种疫苗和驱除肠虫。一般设定3个剂量组。低剂量组目的是寻找动物安全剂量范围，为临床剂量设计作参考。此剂量下应不出现毒性反应。中剂量组应使动物产生轻微的或中度的毒性反应。高剂量组目的是为寻找毒性靶器官、毒性反应症状及抢救措施提供依据，也为临床毒性及不良反应监测提供参考，应使动物产生明显的或严重的毒性反应，或个别动物死亡。,（三）皮肤给药毒性试验皮肤给药毒性试验包括皮肤给药急性试验、长期毒性试验、皮肤刺激实验、皮肤过敏试验。采用的实验动物为兔、豚鼠和大鼠，首选兔。体重要求兔2kg左右、豚鼠300g，大鼠200g，雌雄各半。给药前24小时将动物背部脊柱两侧被毛脱去，脱毛范围约相当于体表面积的10%，兔约150cm2，豚鼠、大鼠约40cm2左右。一般一侧脱毛区为给药区，一侧脱毛区为赋形剂区。,三、免疫学研究（一）免疫学研究在抗感染免疫、免疫生物学研究中应用最广的是Balb/c小鼠和各种免疫缺陷动物在自身免疫性疾病和系统性红斑狼疮的研究中，应用最广的是新西兰黑（NZB）以及新西兰黑和新西兰白的杂交F1代（NZBNZWF1）小鼠动物模型。在变态反应研究中，豚鼠应用得比较多。在移植免疫研究中，移植的异体组织之所以被排斥，是因为受者的免疫系统对供者的组织发生了免疫反应的结果。引起这种免疫反应的抗原称为移植抗原或组织相容性抗原。在小鼠，这一抗原系统称为H-2抗原系统，已经研究得很透彻。不同近交品系小鼠有不同的H-2型，二个相同H-2型品系小鼠间移植，可不发生排斥反应。（二）免疫学应用1单克隆抗体的制备2免疫血清的制备3提供补体,四、实验肿瘤学研究（一）自发性肿瘤模型在自发性肿瘤动物模型中，利用小鼠生长快、生命周期短、近交品系多、自发性肿瘤与人类肿瘤发病相似等特点，可以选用具有不同的遗传性状特点的近交系动物进行肿瘤遗传学和肿瘤病因学研究。缺点:不易同时获得大批病程相似的自发性肿瘤动物，又因这种肿瘤生长较慢，实验周期相对较长，所以一般很少用于筛药。（二）诱发性肿瘤模型用化学致癌物、射线或病毒均可在各类动物中诱发不同类型的肿瘤。如用强化学致癌物二甲基苯蒽（DMBA）和甲基胆蒽可诱发乳癌，二苯苄芘诱发纤维肉瘤，二乙基硝胺（DEN）诱发大鼠肝癌，黄曲霉素诱发大鼠肝癌等。在使用化学剂致癌时，要注意各类化学致癌剂对动物致癌的特点芳香胺及偶氮染料：长期反复亚硝胺类：小剂量一次给药黄曲霉毒素：已知致癌剂中最强的一种,（一）移植肿瘤模型移植肿瘤模型主要利用裸小鼠、裸大鼠及Scid小鼠。将人体肿瘤移植于免疫缺陷动物因能保持其生物学特性，用于研究人体肿瘤对药物的敏感性。常用的人癌组织移植的途径皮下移植、腹腔移植、原位移植肾囊膜下移植,五、遗传学研究在遗传学上用来研究阐明正常遗传及遗传性疾病机理的动物称为模式动物。由于进化的原因，生命在发育过程中的基本模式具有相当的同一性，利用位于生物复杂性阶梯较低级位置上的物种来研究发育共通规律是可能的。因为这些生物的细胞数量更少，分布相对单一，变化也较好观察，而对这些生物的研究有助于人们理解生命世界的一般规律。目前在遗传学研究上公认的模式动物有果蝇、线虫、斑马鱼和小鼠等。,果蝇的染色体数量少，遗传背景清楚，基因定位与表型效应的关系明确，各种遗传分析方法也较成熟，是一种经典的模式动物。线虫的细胞分化谱系明确，为研究细胞细胞间相互作用和特定细胞功能提供了很好的模型。斑马鱼通体透明，它具有体外受精、胚胎透明、体外发育、胚胎早期发育快和易于大量获得样品等独有的特点，是研究器官发生的最佳材料之一。小鼠体形小、繁殖快、生命周期短，与人同属哺乳动物；小鼠的基因组序列已经全部阐明，基因组和人类90同源，且生理生化和发育过程和人类相似。更为重要的是小鼠的胚胎操作技术、胚胎干细胞技术以及基因改造技术