免疫2015抗体.ppt

免疫球蛋白(Immunoglobulin,Ig),1890年，Behring和北里在德国Koch实验室从豚鼠体内发现了第一种抗体：白喉抗毒素，从而挽救了成千上万的白喉患儿，死亡率从60%降到26%。获1901年的第一届诺贝尔奖。,抗体的发现,一、概述:Ig分子是机体中最神奇的、在结构上变换无穷的一类分子。它只由3个基因编码，但却产生100亿以上不同序列的蛋白质分子，应对数以亿计的病原微生物和异己分子。,概念,概念,4,与Ig有关的诺贝尔奖获得者,Ig基因重排发生在B细胞Ig来源于B细胞Ig具有基本的4肽链结构由重链及轻链组成异源二聚体Ig基因重排是Ig表达的前提可变区具有无限的多样性Ig是重要的免疫分子作为BCR识别抗原与发挥抗体活性,经典Ig的概念,免疫球蛋白：具有抗体活性或结构的球蛋白。抗体是免疫球蛋白，但免疫球蛋白不一定都有抗体活性。抗体:主要是B细胞在抗原刺激后，增殖分化为浆细胞所产生的能与相应抗原特异结合的糖蛋白，是体液免疫的效应分子。,根据亚细胞定位Ig分为膜型及分泌型，膜型的称之为B细胞抗原识别受体（Bcellreceiptor,BCR);分泌型称之为抗体（antibody),B细胞分化为浆细胞，产生抗体,B细胞缺失导致外周血Ig减少，体液免疫功能低下，易感染。,抗体的理化性质单体Ig的分子量为150kDa-170kDa；糖基化修饰（糖蛋白）；电泳泳动位置主要为球蛋白；对热相对稳定，（IgE除外）；具有高度不均一性。,二、免疫球蛋白的基本结构,（一）基本结构1、四肽链结构经二硫键共价结合2条重链和2条轻链,Edelman发现抗体的重链和轻链结构,抗体的结构,还原剂,分子筛还原剂,2、重链（heavychain,H）轻链（lightchain,L）,重链：450550aa,5075kDa；（Heavychain）：分为5类（gamma）IgG（mu）IgM（alpha）IgA（epsilon）IgE（delta）IgD亚类：IgG1-4、IgA1-2,5类抗体的结构模式图,轻链：214aa,25kDa；根据其恒定区aa组成和排列顺序（抗原性）不同，分为2型（type）：，；亚型：14。一个天然Ig上的两条轻链的型别是相同的；每个Ig只选用1个型别的轻链（或)，二者功能相同。人：为2：1；小鼠：为20：1。,3、蛋白酶水解片段,-S-S-,S-S,S-S,N,N,C,L,H,VL,CL,VH,CH1,CH2,CH3,木瓜蛋白酶（papain）2Fab，1Fc,胃蛋白酶（pepsin）F(ab)2,pFc,Porter发现Ig的Fab和Fc段,抗体的特异性,轻链及重链可变区共同决定抗体的特异性,可变区（Variableregion）VL(N-L1/2);VH(N-C1/4)恒定区（constantregion)CL(C-L1/2);CH,(C-C3/4),4、功能区和结构域：两条重链和两条轻链都可折叠为数个球形结构域或功能区，每个结构域一般具有相应的功能。,1)可变区（variablregion,VH，VL）,高变区（hypervariableregion,HVR）或互补决定区(complementarydeterminingregion,CDR)：VH和VL中直接与抗原接触结合、氨基酸组成和序列高度可变的区域；骨架区（frameworkregion；FR）：其余区域为骨架区,FR1CDR1FR2CDR2FR3CDR3FR4,V区,2）恒定区（constantregion,CH，CL区）,（1）CH，CL;（2）和的C区长度基本一致；（3）、的C区包括CH1，2，3；而，则含有CH1，2，3，4。（4）针对不同抗原的同一类Ig，其V区不同，但C区相同；而针对同一抗原表位的不同类Ig，其V区相同，C区不同。,5、铰链区（hingeregion）,1）位于CH1-CH2之间，富含Pro；2）具有柔韧性，可折叠分别形成T型和Y型3）易被蛋白酶水解；4）IgG1，2，4和IgA铰链区短；IgG3，IgD铰链区长；IgM，IgE无。,（二）Ig的其它成分,1、J链（joinchain，Jchain）1)浆细胞合成；2)富含半胱氨酸；3)连接2聚体IgA、5聚体IgM。,IgAJchain,2、分泌片（secretorypiece,SP）1)粘膜上皮细胞合成、分泌；2)只存在于粘膜分泌型IgA中；3)作用：保护IgA免受蛋白酶降解；介导分泌型IgA从粘膜粘膜表面,IgASC,三、Ig序列的保守性,尽管Ig在进化过程中其恒定区相对保守，但不同种属间及相同种属不同个体间的相同类型Ig存在序列差异，该结构可以在不同种属间构成免疫原性；同一个体不同Ig分子之间也构成免疫原性。,Ag1,Ab1（Ag2）,Ab2,1、同种型（Isotype）同一种属所有个体均具有的Ig抗原，主要存在于重链和轻链的稳定区中,2、同种异型（allotype，allotope）同一种属不同个体所具有的Ig抗原，主要存在于重链和轻链的稳定区中，由IgC区内一个或数个氨基酸残基的差异所致。如IgG：GM1，GM2，GM3，GM4.IgA:AM1,AM2链：KM1，KM2，KM3同种异型为个体型标志，又称同种异型遗传标志。,AllotypicDeterminants,（三）独特型（idiotype,Id）同一个体不同Ig的抗原，主要存在于Ig的V区。是指每个免疫球蛋白分子可变区肽链所具有的抗原特异性标志（独特位，5-6个）。一定条件下独特型表位可刺激机体产生抗独特型抗体，这对免疫应答的调节有重要意义。Jerne的免疫网学说（Immunenetworktheory）的中心是独特型免疫调节。,IdiotypicDeterminants,Ig的不均一性,数十种,四、五类Ig的特性及功能,Ig分为五类（Class）：IgG,IgM,IgA,IgE,IgD其中IgG,IgA存在亚类（Subclass）：IgG1，2，3，4；IgA1，2,（一）IgG：单体；含量最高；半衰期20-23，可通过胎盘，一般是高亲和力抗体，是免疫功能最强的Ig分子；在免疫应答中起着激活补体，中和多种毒素的作用。是唯一能在母亲妊娠期穿过胎盘保护胎儿的抗体。主要参与抗感染免疫；可引起介导免疫病理损伤。,IgG1、IgG3、IgG4可穿过胎盘屏障，在新生儿抗感染免疫中起重要作用；IgG1、IgG3可高效激活补体，并可与巨噬细胞、NK细胞表面Fc受体结合，发挥调理作用、ADCC作用等；某些自身抗体和引起二、三型超敏反应的抗体也属于IgG。,（二）IgM：含CH4（C4）；膜结合型：单体，BCR；分泌型：五聚体，分子最大，作用最强（结合抗原；激活补体）；最早出现的抗体（个体发育；免疫应答）。,免疫球蛋白的进化,血清型IgM,主要参与抗感染免疫，补体依赖的细胞毒效应（比IgG强500倍）；识别并杀伤肿瘤细胞；识别并清除凋亡及衰老的细胞。中和低密度脂蛋白防止动脉粥样硬化的发生。是机体的忠实卫士。,（三）IgA：血清型：单体；分泌型：双聚体；呼吸道、消化道、乳腺等产生，外分泌液中的主要成分，在粘膜抗感染免疫中起中和作用；初乳中含sIgA。,sIgA的结构,分泌型IgA的形成,IgA在肠道的免疫保护效应,（四）IgD单体，主要存在于B细胞表面（mIgD），mIgD是成熟B细胞的标志。,（五）IgE单体形式，含CH4（C4），体内含量最低。参与抗寄生虫免疫，发挥ADCC效应；参与速发型超敏反应（4）。,（一）识别并结合抗原-中和作用，主要功能（V区）（二）活化补体；（三）调理作用；（四）ADCC；（五）通过胎盘（IgG）和粘膜(分泌型IgA)。（六）免疫病理,五、抗体的生物学活性,抗体与抗原特异性结合发挥免疫效应,抗体的中和作用（neutralization）1、V区特异结合抗原；中和毒素，阻断病原入侵；2、单体Ig：2价；分泌型IgA：4价；IgM：理论价10；实际5。,E:/QiuD/%E7%AC%AC%E4%B8%80%E5%9D%97%E7%A1%AC%E7%9B%98/d/%E5%8A%9E%E5%85%AC%E5%AE%A4/%E5%8A%9E%E5%85%AC%E5%AE%A4/qiu/%E5%9B%9E%E6%9D%A5/%E6%95%99%E5%AD%A6/2012/%E6%95%99%E5%AD%A6/1-cytogn.gif（Complement-dependentcytotoxity）,抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用（Antibody-dependentcellularmediatedcytotoxity，ADCC）效应,调理吞噬,参与免疫病理作用：I、II、III型变态反应参与免疫复合物形成（Immunecomplex）,六、抗体的多样性,抗体多样性（diversity）是指不同抗体的V区结构多种多样，能针对任何不同的抗原特异结合。,SusumuTonegawa发现Ig的基因重排NobelPrize1987,利根川进认为，“不敢冒险的人，或者只会考试得分的人，是不适合于搞科研的”，“科学家的最重要的才能是要有怀疑的能力，要有丰富的想象力”。,利根川进(日，S.Tonegawa)：20世纪70年代他进一步阐明了免疫球蛋白的基因结构，证实了其基因的重排和突变是抗体多样性的根据，使免疫球蛋白多样性的遗传控制找到了依据。,抗体的基因结构及重排的发现,IgGeneLocation,Heavy,kappa,lambda,人胚系基因中Ig基因片段,V片段（Variablesegment）D（Diversitysegment）J片段（Jioningsegment）,重链V区的VDJ重排（Rearrangement）轻链V区的VJ重排,重链可变区的VDJ重组,轻链基因胚系及重排后结构,68,Ig基因可变区重排的两个必要条件,（1）重组信号序列（recombinationsignalsequences,RSS）:由七聚体、九聚体以及两者间的间隔序列组成在各基因片段两侧存在（2）重组活化酶(recombinase)由重组活化基因（RAG）编码有RAG-1和RAG-2两种RAG出现于B细胞发育早期,重排信号序列RSS（recombinationsignalsequence）,69,Vregion,Jregion,通过RSS形成茎襻状结构,抗体多样性产生的机制,组合引起的多样性：众多的片断的随机组合。连接引的多样性起:VDJ连接处的不准确连接和核苷酸插入，即连接处核酸的丢失或加入。体细胞突变:发生在抗原刺激后的成熟的B细胞已经重排过的V基因，常见于CDR区，特别是CDR3。主要是点突变。B细胞的V区基因突变进一步增加V区的多样性。体细胞突变可导致抗体亲和力成熟。,72,重排造成的多样性,1.抗原诱导前（天然发生的）,73,2.连接造成的多样性：即V(D)J重组时接头处的变化，出现N区和P核苷酸的插入,V-regionN1PD-regionN2J-regiontgtgcgaga.tgggatg.ttatgattggattttata.cagc.tgactactggtgtgcgaga.tgggatg.ttatgattggattttata.cagc.tgactactggtgtgcgaga.tgggatg.ttatgattggattttata.cagc.tgactactggtgtgcgaga.tgg.gatgttatgattggat.ttcatacagc.tgactactggtgtgcgaga.tgg.gatgttatgattggat.tctatacagc.tgactattggtgtgcgaga.tggaatg.ttatgattggattttata.cagc.tgactactggtgtgcgaga.tgggatg.ttatgattggattttata.cagc.tgactactggtgtgcgaga.tgggatg.ttatgattggattttata.cagc.tgactactggtgtgcgaga.tgggatg.ttatgattggattttata.cagc.tgactactggtgtacca.caaacctgaacgtattactatggttcggggaccga.accccc.gactactggtgtacca.caaacctgaacgtattactatggttcggggaccga.accccc.gactactggtgtgcgaaag.tgcggtatagtgagagttacta.tgactcttggtgtgcgaaag.tgcggtatagtgagagttacta.tgactcttgg,74,体细胞高突变:成熟B细胞经抗原刺激后发生的序列高频率随机突变，局限于V区，多发生于CDR区，其中RGYW（RA/G，YC/T，WA/T）基序是突变的一个规律；与Ig亲和力成熟相关。,主要是体细胞高突变(somatichypermutation),3.抗原诱导的V区序列的改变,抗体分子多样性,IGHIGKIGL基因片段的组合V504030D23J657VDJ6900300210IgH/Igk(Igl)链的组合6900（300210）3.5106不准确连接多样性至少增加3000倍核苷酸插入多样性增加100倍可能的组合1011-1012重排基因的高频突变突变频率是其它基因的100万倍以上（导致抗体的亲和力成熟）,76,Ig基因同型排斥（isotypeexclusion）,77,Ig基因等位排斥（Allelicexclusion）,（一）多克隆抗体；（二）单克隆抗体；（三）基因工程抗体。,七、抗体的制备,利用抗原免疫动物后从血清中获得的抗体，含有针对不同抗原表位（epi