《吸光光度法工》PPT课件

1,第九章吸光光度法9.1吸光光度法的基本原理9.2光度计及其基本部件9.3显色反应及显色条件的选择9.4吸光度测量条件的选择9.5吸光光度法的应用,2,9.1吸光光度法的基本原理一、概述：比色法：比较溶液颜色的深浅确定组分含量的一种方法。,吸光光度法是基于被测物质的分子对光具有选择性吸收的特性而建立起来的分析方法。,3,经证明：不论溶液有无颜色，当一定波长的光通过该溶液时，总有一定程度的吸光作用。并且随单位体积内溶液中该物质的质点数目增多，对光的吸收越强。分光光度法：测量物质对一定波长光线的吸收程度确定组分含量的方法。,4,特点：,灵敏度高：测定下限可达105106molL-1,10-4%10-5%准确度能够满足微量组分的测定要求：相对误差25操作简便快速应用广泛,5,化学分析与仪器分析方法比较,化学分析：常量组分(1%),Er0.1%0.2%依据化学反应,使用玻璃仪器,准确度高,仪器分析：微量组分(104*选择性好显色剂在测定波长处无明显吸收。对照性好,max60nm.*反应生成的有色化合物组成恒定，稳定。*显色条件易于控制，重现性好。,50,1.显色剂用量（c(M)、pH一定）,9.3.2显色条件的确定,c(R),c(R),c(R),Fe(SCN)n3-n,Mo(SCN)32+浅红Mo(SCN)5橙红Mo(SCN)6-浅红,51,2.显色反应酸度（c(M)、c(R)一定）,pH,pH1pHpH2,52,邻二氮菲亚铁反应完全度与pH的关系,Fe2+3R,31021.3,c(R)R=10-4molL-1,53,pH38为适宜的酸度范围,54,3.显色温度及显色时间,T1(),T2(),A,t(min),另外，还有介质条件、有机溶剂、表面活性剂等,55,9.3.3干扰及消除,1.化学法,测Co2(含Fe3+):(掩蔽法),56,测Co2:(生成配合物性质不同),测Fe3:(控制pH),如不能通过控制酸度和掩蔽的办法消除干扰，则需采取分离法。,57,2.物理法,选择适当的测定波长,58,吸光光度法仪器主要差异比较,59,9.4吸光度测量条件的选择9.4.1入射光的选择1、首先选择在max下进行测量，灵敏度高。对朗伯-比耳定律的偏离小。若最大吸收波长不在仪器可测波长范围内或处于干扰成分有强烈的吸收时2、选择次高峰对应波长为入射波长应选择值随波长改变不太大的区域内的波长。,60,9.4.2参比溶液的选择因吸光的加和性，除有溶质的吸光外，还包括显色剂、溶剂，其他试剂对光的吸收应将显色剂、溶剂，其他试剂对光的吸收的吸收扣除-选择参比溶液参比溶液的选择原则：,61,选择适当的参比溶液,1.仅配合物有吸收，溶剂作参比。如phenFe2+标准曲线2.显色剂或其他试剂略有吸收，空白溶液作参比例:邻二氮菲光度法测Li2CO3中的Fe，参比溶液为不含Li2CO3样品的所有试剂。,62,3.试样液中其它成分有吸收，但不与显色剂反应：显色剂无吸收时：试样溶液作参比。如测汽水中的Fe显色剂略有吸收时：于试液中加入掩蔽剂将被测成分掩蔽，再加入显色剂，将该溶液作参比。,63,9.4.3吸光度读数范围的选择,光度计的读数误差一般为0.22(T),由于T与浓度c不是线性关系，故不同浓度时的T引起的误差不同。,64,吸光光度法中，仪器测量不准也是误差的主要来源。A=-lgT=bc,透过率读数误差DT基本是个常数，因为T的标尺是均匀的，DT是由仪器刻度读数不可靠引起的误差，和T的大小无关,吸光度读数误差DA是随着A的不同而变化，因为A的刻度标尺是不均匀的，DA随着A的增大而增大,65,不同的吸光度数值A下，吸光度读数误差带来的测定浓度误差dc/c是不同的,66,假设T为0.5%，绘制不同透过率下浓度相对误差变化曲线如图9-16（p254）：T过高或过低，dc/c都是很大的，T在适宜的范围内测量误差才是可以接受的利用（9-5）公式令其导数为零，求出：T=0.368（A=0.434）浓度误差最小，约为1.4%。,67,浓度测量的相对误差与T(或A)的关系,实际工作中，应控制T在7010,A在0.151.0之间(调c,b,),68,调整比色皿厚度和取样量等达到,浓度误差大小和T/A的读数范围有关：T=7010%/A=0.151.0时，浓度测量误差为1.4-2.2%；如果要求准确度高些，可控制T=65-20%/A=0.2-0.7,69,吸光光度法的应用,1.单一组分测定（标准曲线法）,1)金属离子:Fe-phen,Ni-丁二酮肟,Co-钴试剂,2)磷的测定:DNA中含P9.2%,RNA中含P9.5%,可得核酸量.,H3PO4+12(NH4)2MoO4+21HNO3=(NH4)3PO412MoO3+12NH4NO3+12H2O,磷钼黄(小),磷钼(V)蓝(大),70,2.多组分的测定,a)在1处测组分x,在2处测组分y,b)在1处测组分x;在2处测总吸收,扣除x吸收,可求y,c)x,y组分不能直接测定P254A1=xl1bcx+yl1bcy(在1处测得A1)A2=xl2bcx+yl2bcy(在2处测得A2),xl1,yl1,xl2,yl2由x,y纯液在1,2处分别测得,71,3)蛋白质测定溴甲酚绿、考马司亮蓝等4)氨基酸测定茚三酮(紫色化合物)5)水质检测:NH4+、NO2-、Mn2+、Fe2+、SO42-、Hg2+-6)药物含量测定比吸光系数定量；荷移光谱法测