总RNA的提取及RT-PCR

RT-PCR技术,一、真核生物基因的表达真核生物的基因含有大量的非编码区，称为内含子（intron），真正编码蛋白的区段是被内含子隔开的，这些编码区叫做外显子（exon）。真核生物的DNA转录成为RNA之后，经过剪切和拼接，去掉这些非编码区，才形成成熟的mRNA，由mRNA再翻译成蛋白质。,基因,mRNA,蛋白质多肽链,真核生物基因的表达,转录,翻译,外显子,内含子,二、RT-PCR技术的应用,RT-PCR是一种将cDNA合成与PCR技术结合分析基因表达的快速灵敏的方法，主要用于：检测mRNA表达信息,进行基因表达差异分析等研究克隆cDNA构建cDNA文库,实验一Trizol法提取细胞总RNA（一步法）,真核细胞总RNA主要由rRNA（80-85%）、tRNA和核内小分子RNA(10-15%)、mRNA（1-5%）组成，其中rRNA、tRNA和mRNA位于细胞质中。大多数真核细胞mRNA在其3端均有一多聚A(PolyA)尾巴。,真核细胞RNA的种类,RNA实验失败的主要原因是RNA酶的污染。由于RNA酶广泛存在而稳定，可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等，只要存在少量的RNA酶就会引起RNA的降解，而所制备的RNA的纯度和完整性又可直接影响RNA分析的结果，所以建立一个无RNA酶的环境对于制备RNA很重要。,实验前的准备,常用的RNA酶抑制剂：焦磷酸二乙酯（DEPC）：与RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合，有高致癌性。（实验准备阶段使用）异硫氰酸胍、氯仿：提取RNA同时也使RNA酶失活。RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。（合成cDNA阶段使用）,1.在实验室最好有专门的RNA操作区，离心机、移液器、试剂等专用。RNA操作区应保持清洁，并定期进行除菌。2.相关耗材(Ep管、Tip头)应先用0.1%DEPC水浸泡过夜并高压消毒。也可直接使用厂家供应的无RNase的Ep管、Tip头。3.金属器械和玻璃器皿应在使用前于180的高温下干烤6hr或更长时间。,4.塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡或用氯仿冲洗5.配制的溶液应尽可能加入DEPC至终浓度0.1%处理12hr以上，然后用高压灭菌除去残留的DEPC。（不能用DEPC或高压灭菌的试剂，如Tris、DTT等，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22m滤膜过滤除菌）6.人的唾液和汗液含有RNA酶，故在操作中应戴手套，避免讲话。,7.一些组织如脾脏比其它组织含有更多的RNA酶；细菌比哺乳动物细胞含有更多的RNA酶。因此从这些样本中制备RNA应采取更严格的预防措施。,Trizol是一种苯酚与异硫氰酸胍(GTC)的混合物，异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离。加入氯仿可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚促使RNA进入水相，离心后，RNA保留在水相中，DNA和蛋白质保留在有机相中。转移水相，加入异丙醇沉淀RNA，从而得到纯化的总RNA。,实验原理,准备试剂：Trizol,氯仿，异丙醇，DEPC水，70乙醇(需用DEPC水配制)Trizol的用量：组织lml50100mg;细胞lml10cm2培养瓶面积或106个细胞,操作步骤,取材:用生理盐水漱口后，含生理盐水约23min，用15ml离心管（4000rpm5min）收集细胞(同管多次离心)，弃上清沉淀中加入1mlTRIzol，旋涡震荡10s重悬沉淀，加样枪打匀溶液后转移至1.5mlEP管，1530放置5min加入0.2ml氯仿，用手摇晃15s，1530放置5min12000rpm离心15min,小心吸取上清，转移至新的1.5mlEp管，加入等体积的异丙醇，1530放置10min12000rpm离心15min，小心去上清，加入1ml70%乙醇，震荡数秒，8000rpm离心5min小心去上清，室温干燥5min，加入10ulDEPC水，打匀55水浴10分钟助溶,RNA保存：溶解在无RNAase的水或TE中，在-70或更低温度中保存时间在一年以内，但避免反复冻融，应分装保存。从富含RNase的样品（如胰脏、肝脏）中分离到的RNA需溶解在去离子甲酰胺中存于-70，至少可以保存一年。需使用RNA时，可以加入NaAc至终浓度0.3M，12000g离心5分钟，70%乙醇洗涤后再用无RNAase的水或TE溶解。,RNA提取结果的鉴定：紫外分光光度法测定260/280nm比值大约为2.0，如果比值过低，表明有蛋白质或酚污染。RNA浓度(g/ml)=OD260稀释度40。,RNA电泳鉴定通过甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA是否有降解电泳检测结果有三条清晰的rRNA带：28S，18S和5S（普通的1%琼脂糖凝胶电泳也可用于鉴定，电泳槽用去污剂处理，水冲干净，用新鲜的电泳缓冲液）,TotalRNA,实验二RT-PCR,cDNA的合成包括第一链和第二链cDNA的合成：第一链cDNA的合成是以mRNA为模板，反转录为cDNA，由逆转录酶催化，该酶合成DNA时需要引物引导，常用引物是oligodT、随机引物或基因特异引物（GSP）。第二链合成是以第一链为模板，由DNA聚合酶催化。,RNA模板,逆转录酶,DNA-RNA杂化双链,RNaseH降解RNA,单链DNA,DNA聚合酶,cDNA,RT-PCR,Taq酶,oligo(dT)18,特异性下游引物,随机引物,两步法RT-PCR,cDNA第一链的合成,常用的反应体系10RT反应缓冲液2uldNTPMixture（各10mM）2ulRNAaseinhibitor(40U/ul)0.5uloligo(dT)181ul逆转录酶1ul总RNA0.51ugDEPCfree水补足体系至20ul,操作步骤：,在发给每人一份的已制备分装的逆转录反应管里加入8ul总RNA溶液,0.2mlEp管，迷你离心机离心数秒，放置PCR仪中,4230min（合成cDNA第一链）855min（灭活逆转录酶）,一步法RT-PCR,在一步法RT-PCR中，逆转录和PCR在同时为逆转录和PCR优化的条件下，在同一管内进行。优势：在处理大量样品时易于操作；减少残余污染；可以得到更高的灵敏度。缺点：无法优化反应条件；一旦失败，必须重新提取总RNA,方案示例：0.1-1ug总RNA200一500umol/L的dNTP(每种)0.5umolL基因特异引物（上下游）200UAMV逆转录酶1Taq聚合酶缓冲液0.5-15mmolLMgCI21mmo1LDTT1.5UTaq聚台酶终体积为50ul。,半定量RT-PCR（semi-quantitativeRT-PCR）,检测特定基因的表达水平，检测的手段主要有Northern、半定量RT-PCR、荧光定量PCR（realtime-PCR/Q-PCR）、基因芯片等手段。,半定量RT-PCR是常用的一种简捷、快速、特异的RNA定量测定方法。通过mRNA反转录成cDNA，再进行PCR扩增,扩增产物以指数形式增长,通过测定PCR产物的数量,就可以推测各样品中特异mRNA的相对含量。虽然此法只能测定mRNA的相对含量,但在比较模型组和对照组样品之间特异mRNA的表达差异时足以说明问题.,1.总RNA的纯度和完整性鉴定总RNA提取之后，用紫外分光光度计测定其纯度和浓度，OD260/280应在1.82.0之间；然后再用1%琼脂糖凝胶对总RNA进行电泳，以鉴定其完整性，浓度不高、完整性不好的标本应谨慎选用，以免影响后面的实验结果。,2.内参基因半定量RT-PCR需选用体内稳定表达且在其它生理条件下不受影响或影响很小的管家基因片段作为内参。半定量RT-PCR多以-actin基因片段作内参，-actin蛋白在各种细胞内的含量都稳定在10%左右。,另外常用的内参照还有GAPDH,它是一种细胞内代谢酶,其基因属于保守性强的“管家基因”,该基因在生物体内普遍存在且稳定表达.-MG、18SrRNA基因也是常用的内参。不同的生物体其生命过程和生理过程各不相同,选用何种内参要根据目的基因和实验的具体情况而定.,3.引物设计为了将扩增的cDNA同痕量的基因组DNA扩增产物分开，可以设计分别同分开的外显子退火的引物。来源于cDNA的PCR产物会比来源于痕量的基因组DNA的产物短。设计扩增内参的引物应使其退火温度与目的基因引物相差小于3，扩增片段与目的基因扩增片段相差200bp以上，便于观测结果。,4.同管扩增半定量RT-PCR属于内标式非竞争性PCR定量技术，内参需要与目的基因同管扩增。有时内参基因表达水平相对目的基因太高，会抑制目的基因的扩增，可采用内参引物后加的方式。,5.PCR循环数的确定PCR反应遵循酶促反应定律，开始的循环内扩增产物呈指数累积,产物与模板呈线性关系,半定量RT-PCR技术正是利用的这一线性关系,通过扩增产物来对比总RNA中目的基因的表达。,RT-PCR应在平台期前结束,否则低水平表达的mRNA可能会增加到与高水平表达的mRNA相同的拷贝数,因此,为避免平台效应的影响,合适的循环数是PCR半定量方法的关键因素之一。（一般为30以内）通过预试验,在不同循环周期取样电泳后灰度分析,以待测基因与内参比值的对数分别与循环周期作图,最后确定扩增效率最大的循环数,这样可有效地避免因平台效应引起的误差,6.结果分析将PCR扩增产物进行电泳，电泳图谱经凝胶分析软件进行灰度分析，得到待测基因与内参基因扩增条带的积分光密度值（IOD），计算各组样品间IOD待测基因/IOD内参基因的比值，比值越大，说明该组样品表达丰度越高。,实验试剂：2PCRMix:Taq酶，四种dNTP，PCR反应buffer引物：上下游特异性引物水（ddH2O）：用以补足体积cDNA,实验操作及注意事项,建立PCR反应体系扩增-actin基因-actin引物2lcDNA4l2PCRMix15l水9ltotalvolume30l,此步注意事项：1.每次加样要换Tip头，以防试剂的互相污染2.避免重复加样或漏加样。3.加样一定要准确，正确使用微量移液器是关键。4.加完试剂后离心将液体汇集管底。5.对没有热盖的PCR仪要加封石蜡油。,扩增-actin基因程序的建立预变性945min变性9445s复性5945s延伸721min续延伸7210min保存4,30cycles,DNA琼脂糖凝胶电泳检测DNA,一、关于电泳与琼脂糖凝胶电泳电泳及其基本原理常用的电泳方法琼脂糖凝胶电泳的特性及其应用（分离、鉴定和纯化）,利用物质的两个差异来分离物质,电荷差异电荷性质电荷数量,分子差异分子大小分子形状,二、关于电泳与琼脂糖凝胶电泳电泳及其基本原理常用的电泳方法琼脂糖凝胶电泳的特性及其应用（分离、鉴定和纯化）,三、DNA琼脂糖凝胶电泳原理,在pH8.0（碱性）的环境中DNA的磷酸基团解离，使DNA在该环境中带上负电荷，在电场中向正极方向泳动，因为各种DNA分子的电荷数、构象、分子量不同，它们在通过凝胶立体网络是所受的动力和阻力不同，所以泳动的速度有差异，达到分离的目的。,实验材料及试剂材料：