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文档简介

WesternBlotting的原理方法及常见问题分析,WesternBlotting的原理实验前应准备的试剂及材料WesternBlotting实验步骤影响Westernblotting成功的要素常见问题分析与对策,南方医科大学中医药学院分子生物学实验室,一、概述通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。,WesternBlotting的原理,组织或细胞样品蛋白的提取试剂蛋白定量试剂丙烯酰胺凝胶配置试剂转膜缓冲液试剂固相载体（PVDFNC尼龙膜）封闭液、洗脱液、抗体稀释液一抗、二抗化学显影液,二、实验前准备的试剂及材料,2.7一抗二抗的选择2.7.1一抗的选择2.7.2二抗的选择,二、实验前准备的试剂及材料,3.1组织或细胞样品蛋白的提取a蛋白种类分类：胞浆蛋白、膜蛋白、核蛋白、磷酸化蛋白线粒体蛋白等。b样品来源分类：单层贴壁细胞、悬浮细胞少量或微量组织样品大量组织样品难裂解组织样品一般组织样品,三、WesternBlotting实验步骤,3.2蛋白定量考马斯亮兰法BCA法Lowry法BCA蛋白定量法操作：,三、WesternBlotting实验步骤,振荡30s，3730分钟，A562nm测定。以蛋白含量（g）为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线；计算出蛋白含量。,3.3凝胶浓度的选择及配置,三、WesternBlotting实验步骤,3.4蛋白Marker的作用,预染或非预染各种分子量的蛋白，用于标示电泳中蛋白的大小和示踪，有利找准自己的目的蛋白。,3.6蛋白样品变性（时间、温度）3.6蛋白样品上样（顺序、体积）3.7电泳,三、WesternBlotting实验步骤,？,三、WesternBlotting实验步骤,3.8切胶、泡胶、叠胶,胶、滤纸、膜浸泡位置,3.9转膜时滤纸、胶、膜的叠加顺序,三、WesternBlotting实验步骤,半干转膜的条件：分子量大小电流=Sx3,叠加示意图,正极,负极,3.10封闭3.11洗脱3.12加一抗（抗体名称、来源、浓度、时间）孵育,三、WesternBlotting实验步骤,3.13洗脱3.14加二抗（抗体名称、来源、浓度、时间）3.15孵育、洗脱3.16加ECL发光液,三、WesternBlotting实验步骤,3.17结果的检测及分析,三、WesternBlotting实验步骤,结果分析例图1,比较均一的高背景斑点、发泡式或闪烁式的高背景信号弱或者无信号非特异性条带弥散型条带白色条带、黑点或信号下降太快,常见问题分析,三、常见问题分析,高背景,高背景,高背景,如图所示:,信号弱或者无信号,信号弱或者无信号,信号弱或者无信号,如图所示：,多非特
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