土壤中细菌总数的测定

土壤中细菌总数的测定摘要：土壤微生物是指生活在土壤中的细菌、真菌、放线菌、藻类的总称。其个体微小，一般以微米或毫微米来计算，通常1克土壤中有106109个，其种类和数量随成土环境及其土层深度的不同而变化。它们在土壤中进行氧化、硝化、氨化、固氮、硫化等过程，促进土壤有机质的分解和养分的转化。关键词：土壤 细菌 培养 灭菌 革兰氏染色前言：土壤微生物可以形成土壤结构，土壤并不是单纯的土壤颗粒和化肥的简单结合，作为土壤的活跃组成分, 土壤微生物在自己的生活过程中，通过代谢活动的氧气和二氧化碳的交换，以及分泌的有机酸等有助于土壤粒子形成大的团粒结构，最终形成真正意义上的土壤。土壤微生物的区系组成、生物量及其生命活动对土壤的形成和发育有密切关系。在植物根系周围生活的土壤微生物还可以调节植物生长，植物共生的微生物如根瘤菌、菌根和真菌等能为植物直接提供氮素、磷素和其他矿质元素的营养以及有机酸、氨基酸、维生素、生长素等各种有机营养，促进植物的生长。土壤微生物与植物根部营养有密切关系。所以，测定土壤中微生物的总数对农业活动及人类生活有重大意义。一实验目的： 1.掌握从环境土壤微生物群体中获得纯种微生物的分离和培养技术。 2.掌握无菌操作技术。 3.掌握革兰氏染色技术。2 实验原理：土壤中细菌总数的测定采用平板培养菌落计数法，土壤细菌的培养基通常选择肉膏蛋白胨培养基。细菌在恒温箱培养24小时后长成菌落，进行计数。并对菌落菌种进行鉴定和革兰氏染色。3 实验材料及器具：土样，肉膏蛋白胨培养基，天平，移液管（6支），锥形瓶(2个)，试管（10支），量筒，培养皿（6个），烧杯，高压蒸汽灭菌锅，蒸馏水等4 实验步骤：1.取样：从肥沃，湿润的土壤中取样，先铲去表层3cm左右，在取样，装入事先灭菌的烧杯中。2.培养基的配制：称量及溶化：分别称取蛋白胨和Nacl的所需量置于烧杯中，加入所需水量的三分之二左右的蒸馏水。用玻璃棒挑取牛肉膏置于另一烧杯中进行称量，然后加入少量蒸馏水溶化，倒入第一个烧杯中。调节pH：用1mol/L的Hcl调节至7.2左右。定容：将溶液倒入量筒中进行补充水量到所需体积。 加入所需的琼脂到锥形瓶中。 用报纸将锥形瓶包扎好放入高压蒸汽灭菌锅（0.1MPa，120） 进行灭菌20min 3.将已经准备好的玻璃仪器进行洗涤，洗涤干净后进行干燥，干燥完成后将玻璃仪器用报纸包扎好放入高压蒸汽灭菌锅进行灭菌，灭菌后取出干燥。4. 制备土壤稀释液 取9.0ml无菌水试管6支，按10-210-7顺序编号，放置试管架上。取无菌移液管一支，从移液管包装纸套中间撕口，将包装纸套分成上、下两段，去除上段包装纸套，在移液管上端管口装橡皮头，取出下段移液管纸套放置桌面，以右手拇指、食指、中指拿住移液管上端的橡皮头，将吸液端口及移液管外部表面迅速通过火焰23次，杀灭撕纸套时可能污染的杂菌，切忌用手指去触摸移液管吸液端口及外部。左手持锥形瓶底，以右手掌及小指、无名指夹住锥形瓶上棉塞，在火焰旁拔出棉塞（棉塞夹在手上，不能乱放在桌上），将1ml移液管的吸液端伸进振荡混匀的锥形瓶中土壤悬液底部，用手指轻按橡皮头，在锥形瓶内反复吹吸三次（吹吸时注意第二次液面要高于第一次吹吸的液面），然后准确吸取1ml10-2土壤稀释液，右手将棉塞插回锥形瓶上，左手放下锥形瓶，换持一支盛有9.0ml无菌水试管，依前法在火焰旁拔除试管帽（或棉塞），将1ml10-2土壤稀释液注入9.0ml无菌水试管内，制成10-3的土壤稀释液，将此移液管在试管内反复吹吸三次，然后取出移液管，并将其通过火焰再插入原来包装移液管的下段纸套内，以备再用。盖上试管帽，右手持10-3稀释液试管在左手上敲打2030次，混匀土壤稀释液。再从纸套中取出原来的移液管，插入稀释液已混匀的试管内，再吹吸三次，然后准确吸出1ml10-3稀释液，置第二支装有9.0ml无菌水试管中，制成10-4的土壤稀释液。用同法再制成10-5、10-6、10-7的土壤稀释液（为避免稀释过程误差，进行微生物计数时，最好每一个稀释度更换一支移液管）。5. 倾注：按无菌操作法向无菌培养皿中倾倒已融化并冷却至4550的3种培养基，待冷凝后，用无菌移液管（或无菌微量移液器）分别吸取上述10-7、10-6、10-5三个稀释度菌悬液0.1ml,依次滴加于相应编号已制备好的肉膏蛋白胨培养基平板上，按照浓度从低到高的顺序涂布平板。右手持无菌玻璃涂棒,左手拿培养皿,并用拇指将皿盖打开一缝,在火焰旁右手持玻璃涂棒于培养皿平板表面将菌液自平板中央均匀向四周涂布扩散,切忌用力过猛将菌液直接推向平板边缘或将培养基划破。 6. 培养：待平板上稀释悬液完全吸收后，将平板倒置于30恒温箱中培养24h。7. 菌落的计数； 当平板上有链状菌落生长时，如呈链状生长的菌落之间无任何明显界限，则应作为一个菌落计，如存在有几条不同来源的链，则每条链均应按一个菌落计算，不要把链上生长的每一个菌落分开计数。如有片状菌落生长，该平板一般不宜采用，如片状菌落不到平板一半，而另一半又分布均匀，则可以半个平板的菌落数乘2代表全平板的菌落数。当计数平板内的菌落数过多（即所有稀释度均大于300时），但分布很均匀，可取平板的一半或1/4计数。再乘以相应稀释倍数作为该平板的菌落数。 计数原则：选平均菌落数在30300之间者进行计算仅1个稀释度的平均菌落数在此范围时，则以该平均菌落数乘其稀释倍数报 告之。若有2个稀释度的平均菌落数在30300之间时，则按两者的菌落总数之比来决定，若比值小于2应报告两者的平均数；若大于2则报告其中较小的菌落总数。若所有稀释度的平均菌落数均大于300，以稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。若所有稀释度的平均菌落数均不在30300之间，则以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。若所有的菌落数匀为“无法计数”时，应注明水样的最大稀释倍数。在求同稀释度的平均数时，若其中1个平板上有较大片状菌落生长时，则不宜 采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌落约 为平板的一半，而另一半平板上菌落分布很均匀，则可按半平板上的菌落计数然后乘以2作为整个平板的菌落数。8. 革兰氏染色：将所培养出来的菌种进行革兰氏染