高分辨率溶解曲线HRMPPT课件

1,SNP及突变研究的最新工具高分辨率熔解曲线（HighResolutionMelting）突变筛查和基因分型系统,北京思博全科技有限公司,2,3,内容提示,高分辨熔解曲线（HighResolutionMelting）高分辨熔解曲线在遗传育种中的应用筛查突变（mutationscanning）基因分型（MutationGenotyping）小片段+内标法（SmallAmpliconGenotyping）非标记探针法（UnlabeledProbeGenotyping，LunaProbe）SSR分析检测甲基化HRM仪器,4,5,HighResolutionDNAMelting（HRM)是基于有序列变化的Amplicon之间微弱的Tm值差异，通过DNA片段熔解曲线的差异进行突变检测，比如：,6,PCR,LightScanner突变检测原理,7,Lightscanner高分辨溶解曲线结果,8,Saturatingdye,LCGreenplus高分辨溶解曲线专用荧光染料,9,内容提示,高分辨熔解曲线（HighResolutionMelting）的定义高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用筛查突变（mutationscanning）基因分型（MutationGenotyping）小片段+内标法（SmallAmpliconGenotyping）非标记探针法（UnlabeledProbeGenotyping，LunaProbe）SSR分析检测甲基化HRM仪器,10,MutationScanning,未知SNP扫描,11,M.H.Ye等对北京油鸡CAPN1基因外显子进行扫描，筛查其潜在SNPs。,12,BernhardJ.HoWngerHai-ChunJingKimE.Hammond-KosackKostyaKanyuka(BarleyApplication)TheorApplGenet(2009)119:851865DOI10.1007/s00122-009-1094-2数据来自英国洛桑农业实验站,Bernhard等对Barley的eukaryotictranslationinitiationfactor4E(eIF4E)gene基因外显子进行突变扫描结果,13,14,内容提示,高分辨熔解曲线（HighResolutionMelting）的定义高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用筛查突变（mutationscanning）基因分型（MutationGenotyping）小片段+内标法（SmallAmpliconGenotyping）非标记探针法（UnlabeledProbeGenotyping，LunaProbe）SSR分析检测甲基化HRM仪器,15,SmallAmpliconGenotyping扩增小片段直接进行基因型鉴定,16,使用已知Tm值的双链DNA做温度内标，低温内标Tm(61),高温内标Tm(92)内标能够实现96/384孔板的温度均一矫正。PCR片段的Tm值范围：70-88优点：不需要探针，直接利用PCR产物针对已知突变位点进行基因分型,17,18,19,20,为何要使用温度内标,21,ATSNPwithoutCalibration72bp,22,ApplyTemperatureCalibration,23,ATSNPwithCalibration,24,SmallAmpliconGenotyping,M.H.Ye等对北京油鸡A-FABP基因进行小片段法基因分型，扩增片段为56bp，灰色曲线显示的是杂合型（CT），蓝颜色和红颜色曲线分别代表纯合型CC和TT。,25,内容提示,高分辨熔解曲线（HighResolutionMelting）的定义高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用筛查突变（mutationscanning）基因分型（MutationGenotyping）小片段+内标法（SmallAmpliconGenotyping）非标记探针法（UnlabeledProbeGenotyping，LunaProbe）SSR分析检测甲基化HRM仪器,26,HRMLunaprobegenotyping,27,HRMLunaprobegenotyping,28,1Probe1SNP,AllPossibleSNPs,29,1Probe1SNP,AllPossibleSNPs,30,1Probe,2SNPs,1Amplicon,31,2Probes,2SNPs,1Amplicon-ApoE,32,2Probes,2SNPs,2Amplicons-HFE,33,AmpliconScanning发现新的突变,34,DavidDe，YongSongatel.Applicationoghigh-resolutionDNAmeltingforgenotypingandvariantscanningofdiploidandautotetraploidpotatoMolBreeding(2010)25:6790,rr,RR,Rr,MixRr:rrby1:1Rrrr,MixRR:Rrby1:1RRRr,35,内容提示,高分辨熔解曲线（HighResolutionMelting）的定义高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用筛查突变（mutationscanning）基因分型（MutationGenotyping）小片段+内标法（SmallAmpliconGenotyping）非标记探针法（UnlabeledProbeGenotyping，LunaProbe）SSR分析检测甲基化HRM仪器,36,RosarioMuleo（2009）等用HRM方法对三个品种的SSRDCA4进行分析，DCA4的等位基因有131bp的重复序列，杂合等位基因的序列为131-133bp，分析结果如图8所示，HRM曲线可以将纯合样品和杂合样品明显的区分，其中一个等位基因只相差2bp。三种颜色（浅灰，深灰、黑色）表明3种不同的品种。,RosarioMuleo等得出结论：HRM是一种快速、重复性高、成本低，操作简单，且可以应用于其他物种的SNP检测及SSR基因分型的方法。,RosarioMuleo,MarirChiaraColao,DarioMianoatel.2009Genome52:252-260,37,内容提示,高分辨熔解曲线（HighResolutionMelting）的定义高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用筛查突变（mutationscanning）基因分型（MutationGenotyping）小片段+内标法（SmallAmpliconGenotyping）非标记探针法（UnlabeledProbeGenotyping，LunaProbe）SSR分析检测甲基化HRM仪器,38,39,40,41,内容提示,高分辨熔解曲线（HighResolutionMelting）的定义高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用筛查突变（mutationscanning）基因分型（MutationGenotyping）小片段+内标法（SmallAmpliconGenotyping）非标记探针法（UnlabeledProbeGenotyping，LunaProbe）SSR分析检测甲基化HRM仪器,42,2005LightScanner96/38496/384孔板8分钟/板2-6秒/样品温度均一性：0.15oC数据采集速度：大于100pts/秒升温速度：0.1oC/秒,2010LS3232样品转盘,玻璃毛细管HRM检测60分钟内完成定量PCR和HRM检测HRM检测升温速度可以在0.050.90oC/秒之间调节在升温速度小于0.3/秒时，温度均一性：0.05oC数据采集速度：20pts/秒400pts/秒（与升温速度有关）0.3oC/秒升温速度=67pts/0.05oC/秒升温速度=400pts/,43,LightScanner高分辨溶解曲线应用,LunaProbes非标记探针基因分型,未知SNP扫描,SmallAmplicon小片段基因分型,44,HRM分析流程,在PCR反应前加入LCGreen荧光染料时间大约2小时（包含试剂准备）在LightScanner上进行高分辨溶解曲线分析大约需要5-10分钟数据分析和处理大约需要5-10分钟PCR产物可以直接进行下游的测序分析等（如需要）大约需要30-60分钟,45,LightScanner适于SNP分析,速度、通量LightScanner510分钟完成96/384孔板的PCR产物检测，20000个SNP/天