微生物学检验-厌氧性细菌及检验.ppt

厌氧性细菌及检验,微生物教研室,一定义,有氧条件下不能生长，无氧条件(不是绝对）下才可以生长的一类细菌1836年Pasteur提出临床上日益受到重视，60%临床标本存在厌氧菌感染-需要重视,二分类,1有芽孢厌氧性细菌一个梭菌属包括83个种2无芽孢厌氧性细菌40多个菌属，300多个菌种和亚种,三感染,分布原因临床症状,厌氧性细菌广泛分布于自然界、人及动物体表以及与外界相通的腔道内，如口腔、上呼吸道、胃肠道、泌尿生殖道粘膜和皮肤等上，是人体正常菌群中的重要组成部分，也容易引起相关部位的内源性感染。约60%的临床感染，有厌氧菌参与。厌氧菌在肠道中约占99%。结肠中厌氧菌与需氧菌的数量为1000:1，即99.9%的细菌都是厌氧菌。其中，厌氧芽胞梭菌与医学关系最为密切。无芽胞厌氧菌所引起的内源性感染最为多见，逐步被医学界所重视。,厌氧菌在正常人体内的分布,致病的原因,1组织缺氧或氧化还原电势降低穿刺伤等封闭性伤口，血管压迫，肿瘤压迫等等2机体免疫力低下,临床的症状,1感染部位产生大量气体，组织脓肿和坏死，皮下有捻发音，是产气夹膜梭菌感染的特征2分泌物有恶臭，或为暗红色，分泌物涂片经革兰氏染色，发现细菌，而培养阴性的3其它等等,厌氧菌感染的临床及细菌学特征,感染发生于黏膜附近深部外伤感染局部有气体产生分泌物有恶臭或暗血红色某些抗生素治疗无效的感染标本直接涂片细菌染色不均镜检见细菌,需氧培养无细菌培养,厌氧菌标本的采集和送检,标本的采集和送检-1标本决不能被正常菌群污染；2应尽量避免空气,厌氧菌标本采集与送检,采集部位恰当正确采集避免污染严格厌氧及时送检,运送针筒运送法无氧小瓶运送法标本充盈运送法组织块运送法厌氧袋运送法棉拭运送法,标本的采集,标本的送运与处理,针筒送运法无菌小瓶送运法大量标本送运法（标本充盈运送发）组织块送运法厌氧袋送运法棉拭送运法,厌氧菌标本的送检方法与处理,标本送到实验室后，应在2030min内处理完毕，最迟不超过2h，以防止标本中兼性厌氧菌过度繁殖而抑制厌氧菌的生长。如不能及时接种，可将标本置室温保存（一般认为，冷藏对某些厌氧菌有害，而且在低温时氧的溶解度较高）。1）针筒运送：一般用无菌针筒抽取标本后，排尽空气，针头插入无菌橡皮塞，以隔绝空气，立即送检。这种方法多用于液体标本的运送，如血液、脓液、胸腹水、关节液等医.学教育网搜集整理。2）无氧小瓶运送：一般采用无菌的青霉素小瓶，瓶内加一定量的培养基和少量氧化还原指示剂，用橡皮盖加铝盖固定密封，排除瓶内空气，充以C02气体。同时先观察瓶内氧化还原指示剂的颜色，以判断瓶内是否为无氧环境，如合格将用无菌注射器将液体标本注入瓶中即可。3）棉拭子运送：一般不采用棉拭子运送，如果使用该方法，一定使用特制运送培养基，确保无氧环境，确保不被污染，确保快速送检。4）厌氧罐或厌氧袋运送：将厌氧罐或厌氧袋内装入可有效消耗氧气的物质，确保无氧环境。该方法一般用于运送较大的组织块或床边接种的培养皿等。,分离和鉴定,检验的方法,1肉眼观察2直接镜检一些特殊的特点，临床工作中的总结可对初步判断及临床应用做早一步的指导作用,厌氧菌标本观察和涂片镜检,肉眼观察：观察标本的性状（脓性、带血、气味、硫磺样颗粒、坏死组织等）涂片染色镜检：估计细菌数量、观察细菌形态、染色性，以便选择培养基和培养方法,3分离培养,1初代培养1）培养基的选择强化血琼脂平板卡那万古霉素冻溶血琼脂平板七叶苷胆汁平板等等,厌氧菌分离培养,初代培养：厌氧培养48h次代培养：挑5个以上不同菌落做耐氧试验，每个菌落接种2个平板，分别进行需氧培养和厌氧培养，挑取有氧培养中不生长、厌氧培养生长的菌落进行鉴定,厌氧菌常用培养基,非选择性培养基心脑浸液5脱纤维羊血氯化血红素维生素K选择培养基七叶苷胆汁平板培养脆弱类杆菌卡那万古冻溶血琼脂平板培养FS培养基培养梭杆菌属VS培养基培养韦容球菌CCFA培养基培养艰难梭菌,2）标本的接种每份标本应接种3个培养平板，分别放置于有氧，无氧和含5%10%的CO2的容器中，有时需要专用的培养基,3）厌氧培养法a厌氧罐培养法b气袋法c气体喷射法d厌氧手套箱法e其它等等,厌氧菌厌氧培养法,疱肉培养法焦性没食子酸法1g焦性没食子酸和20%氢氧化钠0.5ml厌氧罐培养法(常用抽气换气法和冷触酶法)厌氧器袋法(袋内装有硼氢化钾、碳酸氢钠、枸橼酸)厌氧手套箱法,2次代培养和厌氧菌的确定,3分离培养中可能失败的原因1）培养前为做标本的直接涂片和染色镜检2）标本在空气中放置太久或接种时时间过长3）未用新鲜配制的培养基,4）未用选择性培养基5）无合适的厌氧罐或装备出现问题6）培养时间不足7）.,鉴定实验,1形态和染色重要的是为下一步的鉴定提供参考，时间破伤风梭菌革兰氏染色改变拉丝实验加KOH30g/l一滴，能拉丝为阴性不能为阳性,PH痤疮丙酸杆菌7.0时阴性及多型性6.0及以下革兰氏阳性杆菌,2菌落性状1）色素产黑色素类杆菌210天可产生黑色素；溶齿放线菌培养34天产生粉红色色素2）溶血产气夹膜梭菌在新鲜的血琼脂平板上可产生双溶血环3）荧光,3抗生素敏感实验4一些特殊的敏感实验聚茴香脑磺酸钠敏感实验5生化特性6气液相色扑7PCR等等,第三节厌氧芽孢梭菌,简介梭菌属G+陈旧性培养基G-,破伤风芽孢梭菌主要性状,一、生物学性状,革兰染色阳性（形成芽胞时易变为阴性），菌体细长。无荚膜，有周身鞭毛。芽胞正圆形，比菌体粗，位于菌体顶端，使细菌呈“鼓槌状”，为本菌特征。,生物学特性,破伤风芽孢梭菌主要性状,专性厌氧在血平板上呈扩散生长，菌落边缘不整齐，呈羽毛状在疱肉培养基中，肉汤均匀混浊，肉渣消化微变黑，可产生少量气体，有腐败恶臭味,生化反应一般不发酵糖类，能液化明胶，产生H2S，形成吲哚，不还原硝酸盐。对蛋白质有微弱消化作用。,抵抗力,本菌繁殖体抵抗力与其他细菌相似，但芽胞抵抗力强大。在土壤中可存活数十年，能耐煮沸1H,干热150摄氏度1H。对青霉素敏感，磺胺类有抑菌作用。,致病性,通过创伤进入机体-破伤风,致病性与免疫性,破伤风梭菌芽胞广泛分布于自然界中可由伤口侵入人体，发芽繁殖而致病，但破伤风梭菌是厌氧菌，在一般伤口中不能生长，伤口的厌氧环境是破伤风梭菌感染的重要条件。窄而深的伤口（如剌伤），有泥土或异物污染，或大面积创伤、烧伤、坏死组织多，局部组织缺血或同时有需氧菌或兼性厌氧菌混合感染，均易造成厌氧环境，局部氧化还原电势降低。有利于破伤风杆菌生长,致病条件,伤口需形成厌氧微环境伤口窄而深（如刺伤），有泥土或异物污染大面积创伤、烧伤，坏死组织多，局部组织缺血有需氧菌或兼性厌氧菌混合感染的伤口无侵袭力，仅在局部繁殖，其致病作用完全有赖于病菌所产生的外毒素（包括破伤风毒素和溶血毒素）,致病因子,对氧敏感的破伤风溶血毒素(tetanolysin)质粒编码的破伤风痉挛毒素(tetanospasmin)属神经毒(neurotoxin)，毒性极强(对人致死量1g)蛋白质，不耐热,破伤风痉挛毒素,结构菌体：一条多肽释出菌体：轻链（A链）-S-S-重链（B链）B链：神经节苷脂结合的单位A链：毒性作用,破伤风梭菌能产生强烈的外毒素，即破伤风痉挛毒素（Tetanospasmin）或称神经毒素(Neurotoxin)。破伤风毒痉挛毒素是一种神经毒素，为蛋白质，由十余种氨基酸组成不耐热，可被肠道蛋白酶破坏，故口服毒素不起作用。在菌体内的痉挛毒素是单一和一条多肽链，分子量15万。破伤风毒素的毒性非常强烈，仅次于肉毒毒素。破伤风梭菌没有侵袭力,破伤风痉挛毒素作用机制,与神经系统的结合B链识别运动神经元外胞浆膜上的受体并结合，促使毒素进入细胞内小泡中内在化作用小泡从外周神经末稍沿神经轴突逆行向上，到达运动神经元细胞体，进入传入神经末稍，最终进入中枢神经系统,破伤风痉挛毒素作用机制,膜的转位通过重链N端的介导产生膜的转位使轻链进入胞质溶胶胞质溶胶中作用靶的改变A链发挥毒性作用，使储存抑制性神经介质小泡膜蛋白发生改变，阻止抑制性神经介质-氨基丁酸的释放，使肌肉活动的兴奋与抑制失调，造成麻痹性痉挛,典型的症状苦笑面容牙关紧闭颈项强直角弓反张,苦笑面容,牙关紧闭,角弓反张,（,（三）致病特点1、破伤风为创伤性感染；2、致病需特定条件；3、破伤风梭菌仅在感染局部繁殖，产生的毒素在体内扩散而作用于中枢神经系统，引起破伤风；4、以骨骼肌肉强直性收缩为突出临床表现。,免疫性,破伤风免疫属外毒素免疫，主要是抗毒素发挥中和作用（毒素与中枢神经组织结合非常牢固，一旦结合即非抗毒素所能中和）。注射TAT（破伤风抗毒素）用于紧急预防。病后不会获得牢固免疫力，病后免疫力不强。获得有效抗毒素的途径是人工免疫,微生物学检查法,一般不进行涂片镜检和分离培养典型的症状和病史即可作出诊断,微生物学检验,标本采集检验程序检验方法和鉴定,防治原则,防止创口厌氧微环境的形成特异性预防：注射破伤风类毒素三联疫苗免疫程序：3、4、5月3次2、7岁加强2次特殊情况1次紧急预防：注射破伤风抗毒素（tetanusantitoxin，TAT）特异性治疗：早期足量使用抗毒素及抗生素,防治原则,破伤风一旦发病，治疗困难，应以预防为主。预防：（1）非特异性预防：正确处理伤口及清创，防止厌氧微环境的形成，是重要的非特异性预防措施。（2）特异性预防：1）人工主动免疫：注射类毒素目前我国采取白喉、百日咳和破伤风类毒素三联疫苗（DPT）对儿童进行预防接种。用于远期预防。,2）人工被动免疫：注射破伤风抗毒素紧急预防对伤口较深或大面积创伤可能有泥土污染者,除用类毒素加强免疫外，应肌肉注射1500-3000单位破伤风抗毒素（Tetanusantitoxin,TAT）,创伤严重者剂量加倍。,治疗：（1）非特异性治疗:应用抗生素大剂量的青毒素（或四环毒）能有效地抑制破伤风梭菌在局部病灶中繁殖，并且对混合感染的其他细菌也有作用。（2）特异性治疗:对已发病的病人,应早期足量注射TAT,一般10-20万单位。注射前必须作皮肤试验，防止马抗毒素血清过敏性休克的发生。,（3）对症治疗：若已确诊为破伤风时，应及时采取给予适当的镇静剂和肌肉解痉剂等措施，以减轻病人的痛苦和预防病人呼吸肌痉挛而窒息死亡。,二、产气荚膜梭菌,(Cperfringens),生物学性状形态与染色,革兰阳性粗大杆菌芽胞位于次极端，呈椭圆形，不大于菌体无鞭毛体内有明显的荚膜,为革兰氏阳性粗大梭菌，3411.5um。单独或成双排列，有时也可成短链排列。芽胞呈卵圆形，芽胞宽度不比菌体大，位于中央或末次端。培养时芽胞少见，须在无糖培养基中才能生成芽胞。在脓汁、坏死组织或感染动物脏器的涂片上，可见有明显的荚膜，无鞭毛，不能运动。,培养特性,生长迅速，代谢活跃血琼脂平板：双层溶血环（靶形溶血）内环完全溶血-毒素外环不完全溶血-毒素,厌氧程度不如破伤风梭菌要求高。在血液琼脂平板上菌落较大、灰白色、不透明，边缘呈锯齿状，多数菌株有双层溶血环，内环是毒素的作用，而外环不完全溶血是a毒素所致。不能消化已凝固的蛋白质和血清。,双层溶血,内环完全溶血,外环不完全溶血,培养特性,牛乳培养基中，可出现“汹涌发酵”，此为本菌具有特征性的生化试验。,“汹涌发酵”现象,产气荚膜梭菌在牛乳培养基中分解乳糖产酸使酪蛋白凝固，同时产生的大量气体使凝固的酪蛋白冲成蜂窝状，气势凶猛，成为“汹涌发酵”现象。,能分解多种糖类，如葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和乳糖，产酸产气，不发酵甘露糖或水杨苷，能液化明胶，产生硫化氢，,致病性致病物质,外毒素,致病物质,毒素以A型产生量最大毒素为卵磷脂酶，是细胞毒素，引起血管通透性增加伴大量溶血、组织坏死、肝脏、心功能受损在气性坏疽的形成中起主要作用、毒素引起坏死损伤和血管通透性增加肠毒素,致病条件与破伤风梭菌相似。产气荚膜梭菌既能产生强烈的外毒素，又有多种侵袭性酶，并有荚膜，构成其强大的侵袭力，引起感染致病。,所致疾病,1气性坏疽2食物中毒3急性坏死性肠炎,1.气性坏疽（gasgangrene）以局部水肿、产气、肌肉坏死及全身中毒为特征。多见于战伤、伤口污染的骨折及软组织损伤。主要由A型产气荚膜梭菌引起致病条件与破伤风梭菌相同潜伏期短，发展迅速，病情险恶，死亡率高，以组织坏死，气肿和全身中毒为特征组织坏死、血管内皮损伤，通透性上升出血、水肿、局部坏死分解糖产气，压迫软组织、血管加重组织坏死（捻发音）分解组织，病变迅速扩散，引起全身中毒症状,2.食物中毒食入被大量细菌污染的食物（多为肉类）临床表现：腹痛、腹胀、水样腹泻；可自愈,微生物学检查法,1.直接涂片镜检深部创口取材涂片革兰阳性大杆菌白细胞少且不典型伴有其它杂菌早期诊断能避免病人最终截肢或死亡,直接涂片镜检从伤口深部取材涂片，革兰氏染色镜检，可见革兰氏阳性大杆菌，并有荚膜，常伴有其他杂菌，白细胞甚少，形态不规则，这是气性坏疽标本涂片的特点。,2.分离培养及动物实验接种血平板或庖肉培养基，镜检及生化反应鉴定如怀疑食物中毒，在发病后一日内，检出大于105病菌/克食品或106病菌/克粪便可确立诊断,3动物实验取培养液0.51ml给小鼠或家兔静脉内注射，10分钟后杀死动物，置3758小时。如动物躯体膨胀，即行解剖，可见脏器和肌肉内有大量气泡，尤以肝脏最为明显，称“泡沫肝”。取内脏或心血涂片镜检或分离培养，可发现有革兰氏阳性大杆菌，并有明显荚膜。,防治原则,预防及时处理伤口，破坏和消除厌氧微环境预防性的使用抗生素治疗局部感染的处理抗生素抗毒素高压氧舱法,三、肉毒梭菌,（Cbotulinum）,生物学特性,芽胞呈椭圆形，粗于菌体，位于次极端，使细胞呈汤匙状或网球拍状根据神经毒素的抗原性分AG7个型，各型毒素只能被同型抗毒素中和肉毒毒素不耐热，煮沸1分钟即可被破坏,致病性,致病物质主要为外毒素-肉毒毒素（是已知最剧烈的毒素）剧毒（对人致死量为0.1g)功能和致病机制与破伤风外毒素相似,致病性,致病物质-肉毒毒素-剧毒(对人的致死剂量是0.1g)-嗜神经毒素作用部位脑神经核外周神经肌肉神经接头处阻止乙酰胆碱的释放自主神经末梢运动神经末梢功能失调肌肉松弛性麻痹（软瘫）,作用机制,作用于外周神经肌肉接头处，抑制外周神经介质乙酰胆碱的释放，导致弛缓性麻痹前体分子存在，可稳定存在于外环境和胃肠道。复合物进入小肠后，在碱性情况下解离，被吸收进入血循环,所致疾病,其主要致病物质为外毒素，引起食物中毒，也可侵犯神经系统，引起神经麻痹症状。进食污染食物（多为罐头、肉制品、豆制品）发生食物中毒-食入毒素临床表现：少见胃肠道症状，主要为神经末梢麻痹（松驰型）乏力、头痛眼肌麻痹：复视、斜视、眼睑下垂咽部肌肉麻痹：吞咽、咀嚼困难、口齿不清膈肌麻痹，呼吸困难窒息死亡神志清楚病死率高,所致疾病,婴儿肉毒病细菌进入肠道，繁殖，产生毒素而致病以6个月以内的小婴儿居多症状与肉毒食物中毒类似，便闭、吸乳、啼哭无力病死率不高,微生物学检查法,标本食物中毒患者：食物婴儿肉毒病患者：粪便粪便、食物等标本可先80C加热10分钟，再厌氧培养毒素检查,防治原则,加强食品卫