菌种的筛选和分离

工业微生物菌株的分离与筛选资料来源：青岛海波首先，微生物行业对菌株的要求(1)微生物工业的生产水平由三个因素决定：生产菌株的性能、发酵和纯化工艺条件以及生产设备。其中，生产菌株的性能是最重要的因素。(2)、微生物行业对菌株的要求是：(1)该菌株产量高，能够在短时间内产生大量发酵产物；(2)发酵过程中不产生或很少产生副产物和其他类似目标产物的产物；(3)生长繁殖能力强，生长速度快，产孢菌株应具有较强的产孢能力；(4)原理可以有效地转化为产品；(5)可以利用多种原料，对发酵原料成分的波动敏感性小；(六)对需要添加的前体物质有耐受性，不能将这些前体物质用作一般碳源；(7)发酵过程中产生的泡沫较少；(八)具有抗噬菌体的能力；(9)遗传稳定性，二。工业微生物的来源和繁殖(一)微生物菌株的来源一般来说，菌种的收集、样品的收集、分离和筛选是通过以下方式进行的：(1)根据数据直接从科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门申请或采购；(2)从自然界收集和分离样品；(3)从部分发酵产物中分离筛选目标菌株。目前，发酵工业用菌株的总趋势是从野生菌株到突变菌株，从自然选择到代谢育种，从诱导基因突变到基因重组定向育种。(2)微生物工业菌株的分离1、野生菌株的分离和筛选过程(1)分离和筛选新菌株的步骤菌株分离的过程如下：样品采集、样品材料预处理、富集培养、菌种初筛、菌种复筛、性能鉴定和菌种保存(1)取样取样季节：初秋气温适中，降雨量少为佳。土壤采集方法：选择合适的地点后，用小铲子清除表层土，取离地面5-15厘米左右的10克土壤，放入干净的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，做好标记，记录取样时间、地点、环境条件等。供将来参考。为了最大限度地减少土壤样品中微生物数量和类型的变化，样品应逐步分批送回，以便及时分离。样品预处理纯菌株分离：通过划线分离、稀释分离等纯化方法获得单个菌落。(5)高产菌株的筛选：该步骤采用与生产相似的培养基和培养条件，通过三角瓶容量进行小规模发酵试验，获得适合工业化生产的菌株。还测定了该菌株的发酵性能。毒性试验：根据一些国家的规定，除啤酒酵母、脆性壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草芽孢杆菌外，其他微生物需通过两年以上的毒性试验。2.菌株的分离方法(1)应用选择性压力分离方法主要是利用不同种类的微生物，这些微生物的生长和繁殖对环境和营养有不同的要求，如温度、酸碱度、渗透压、氧气、碳源、氮源等。人工控制这些条件，以促进某一种微生物或某一种微生物的生长，但不利于其他种类微生物的生存，从而达到使目标菌株占优势并快速分离纯化的目的。如果培养过程中的氧气可以控制，好氧微生物和厌氧微生物就可以分离。通过控制温度，可以分离嗜热微生物和非嗜热微生物。控制酸碱度可以分离嗜酸和嗜碱微生物。也可以向分离介质中加入不同的抗生素或试剂，以提高选择性。例如，当分离放线菌和细菌时，可以加入抗真菌抗生素。分离真菌时，可以加入抗菌药物。(2)随机分离法一些微生物产品没有直接的选择性指标常用的抗肿瘤产药细菌分离方法有生化诱导法、SOS显色检测法和DNA修复能力突变株。原理是利用脱氧核糖核酸的损伤来使微生物变异。B1。生化诱导法：将大肠杆菌的lacZ基因连接在噬菌体的PL启动子下，当DNA被破坏时，诱导阻遏物CI的分解，PL启动子启动lacZ基因的转录，并测定表达的半乳糖苷酶活性以检测药物的存在。B2。SOS显色检测方法：当DNA被破坏时，可以激活yecA蛋白进一步分解噬菌体的阻遏蛋白，然后使sifA基因启动lacZ基因的转录，并测定表达的半乳糖苷酶活性以检测药物的存在。C.生长因子产生菌的分离以氨基酸产生菌为例，介绍了筛选方法。首先将待测细菌接种到添加有抗真菌化合物(如亚氨基环己酮)的分离培养基中生长，然后将菌落影印到能够支持产氨基酸细菌生长的培养基中，培养2-3天后，用紫外线杀死好的菌落，然后在平板上铺展一层相应的营养缺乏型细菌悬液，培养16小时后，在被杀死的产氨基酸细菌菌落周围形成检测细菌的生长圈。(3)目标微生物的分离a .根据形态学筛选突变菌株b .根据平板菌落生化反应筛选变异体透明圈法、色圈法、抑菌圈法、浊圈法等。(1)透明圈法：在平板培养基中加入溶解性差的底物，使培养基浑浊。能够分解底物的微生物会在菌落周围产生透明的圆圈，其大小最初反映了菌株利用底物的能力。该方法广泛用于水解酶产生菌的分离，如脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶和核酸酶产生菌，它们都在含有底物的选择性培养基平板上形成肉眼可见的透明圆。当分离产生有机酸的菌株时，透明圈法通常用于初步筛选。向选择性培养基中加入碳酸钙，使平板混合，并将样品悬浮液涂在平板上进行培养。由于生产菌可以水解菌落周围的碳酸钙，形成透明的透明圈，因此很容易识别。当分离产乳酸的细菌时，由于乳酸是一种强有机酸，所以添加到培养基中的碳酸钙不仅具有鉴定作用，而且具有酸中和作用。(2)变色环法：对于一些不容易产生透明环产品的细菌，可以在基板上添加指示剂或显色剂，使所需的微生物能够被快速识别。例如，当筛选产果胶酶的细菌时，使用含有0.2%果胶作为唯一碳源的培养基平板来分离含微生物的样品。菌落长大后，加入0.2%刚果红溶液染色4小时，在具有果胶分解能力的菌落周围出现深红色水解圈。当分离产谷氨酸细菌时，可以向培养基中加入溴百里酚蓝，它是一种酸碱指示剂，颜色变化范围为pH 6.2-7.6，pH 6.2以下时为黄色，pH7.6以上时为蓝色。如果产酸细菌出现在平板上，其菌落的外围会变黄，可以从这些产酸细菌中筛选出谷氨酸细菌。(3)生长圈法：生长圈法通常用于分离和筛选产生氨基酸、核苷酸和维生素的细菌。仪器细菌是一些相应的营养缺陷型菌株。将待检测的细菌涂在含有高浓度工具细菌且缺乏培养所需营养的平板上。如果某一菌株能合成平板所需的营养物质，该菌株的菌落周围就会形成一个混浊的生长圈。例如，将嘌呤营养缺陷型大肠杆菌(如大肠杆菌264)和不含嘌呤的琼脂混合成倒置板，将含细菌的样品涂在倒置板上保温培养，倒置板周围有生长圈的菌落为嘌呤产生菌。抑菌圈法：常用于抗生素产生菌的分离和筛选从自然界中分离和筛选微生物菌株是我们获得优良新菌株的最基本、最主要的方法。因此，分离和筛选食品工业中的菌株是一项重要的、长期的和艰巨的工作。自然界中有各种各样的微生物，尤其是土壤，它是微生物的基础。因此，几乎所有的微生物都能从土壤中分离出来。此外，不同的优势微生物存在于不同的自然环境中。不同的微生物可以从各种食品、农副产品和其他营养成分中分离出来。食品工业中常用的菌株分离源包括受污染的生产或科研菌株、用于长期生产的菌株、发酵食品的菌株、动物肠道菌群、通过各种育种方法处理的微生物材料和天然菌株样品。自然界的微生物是混合的。为了从其中分离微生物，不仅需要考虑分离源应该包含大量的目标细菌，还需要在分离操作中将其与其他细菌分离。对于样品中含量较低的细菌，应根据其生物学特性，如富集培养、选择性培养、特殊生理反应产生的特定生长现象等，合理设计分离方法。以便从大量杂菌中选择目标细菌。从混合群体中分离特定微生物的常用方法包括：控制分离培养基的营养成分、控制培养基的酸碱度、添加抑制剂、控制培养温度、控制空气条件以及对样品进行特殊处理。常见的纯种分离方法包括划线平板法、简单平板分离、稀释分离、包被分离、毛细管分离、显微操作单细胞分离等。在本实验中，将采用稀释法和涂布法来分离和筛选目标微生物。细曲霉的分离采用透明圈法，即样品首先在淀粉琼脂培养基中培养。由于糖化酶的作用，生长的菌落周围的淀粉被水解，当暴露于碘时变成无色透明的圆形，而平板的其余部分是蓝色的。一般来说，透明圈的直径越大，细菌的糖化力越强。糖化能力强的菌株可以根据透明圈的大小进行筛选。采用溴甲酚绿牛奶营养琼脂平板法分离酸奶中的乳酸菌。溴甲酚绿指示剂在酸性环境中为黄色，在碱性环境中为蓝色。溴酚绿指示剂被添加到分离介质(pH6.8)中，并变成蓝绿色。乳酸菌在培养基中生长，分解乳糖产生乳酸，使菌落变黄，菌落周围的培养基也变黄。乳酸可以通过纸层析来鉴定。3种材料3.1样品黑曲霉发酵剂、酸奶。3.2电器和其他用品盘子、三角瓶、涂布机、试管、玻璃珠、纱布。3.3培养基和试剂2%淀粉仔培养基、卡介苗乳培养基、0.02毫升/升碘溶液、10%乳培养基、无菌生理盐水。4流程4.1优良糖化酶菌株的分离和筛选熔化培养基、倾倒平板、分散孢子聚集体、梯度稀释、涂布平板、培养观察、滴加碘溶液、挑选菌落、接种、培养、糖化酶活性测定、菌种保存4.2从酸性乳制品中分离乳酸菌准备培养基、倾倒平板、梯度稀释、涂布平板、培养和观察、挑选菌落、接收乳管、培养和观察、传代培养、选择凝乳管、测量乳酸和保存菌株5步5.1优秀糖化酶菌株的分离和筛选(1)将淀粉直拉法培养基熔化，稍微冷却后倒入几个平板和斜面。(2)取少量种子酵母，加入装有玻璃球的10毫升无菌盐瓶中。用力摇动，使孢子聚集体破碎，形成均匀的孢子悬浮液。然后用无菌纱布在无菌试管中过滤。(3)用10倍稀释法将滤液释放至10-7，三种稀释液各取0.2毫升，用无菌涂布机将2-3个培养皿依次涂布在淀粉琼脂平板上，在30培养1-2天.(5)性能测量：测量每个菌落的糖化酶活性。5.2从酸性乳制品中分离乳酸菌(1)卡介苗奶营养品(2)将2克琼脂溶于50毫升水中，加入1克酵母抽提物，溶解后调节酸碱度至6.8，在0.1兆帕下灭菌20分钟。(3)在无菌操作中趁热将上述两种溶液混合均匀，倒入6个平板，凝固后在37培养24小时。如果没有杂菌生长，它可以使用。(2)用10倍稀释法将样品稀释至10-7倍，分别取0.1-0.2ml 10-7倍和10-6 2倍稀释液，分别置于营养板上，用无菌涂布机依次涂布2-3个培养皿，在43培养48h如果圆形的稍平的黄色菌落和周围的培养基也是黄色的，它们最初被称为乳酸菌。(3)将典型菌落转移到脱脂乳发酵管中，在