《微生物鉴定指导原则》解读

微生物鉴定指导原则解读 梅里埃诊断产品（上海）有限公司 工业市场部 梅里埃诊断产品（上海）有限公司 工业市场部 2 药典发布 第十届国家药典委员会根据 中国药典 第十届国家药典委员会根据 中国药典2015年版编制 大纲要求，开展了药典各部 附录整合、增修订及单独成 卷工作。 年版编制 大纲要求，开展了药典各部 附录整合、增修订及单独成 卷工作。 通过三次的意见征集，目前 已正式发布并实施了中国 药典 通过三次的意见征集，目前 已正式发布并实施了中国 药典2015年版，共四部内 容。 年版，共四部内 容。 其中第四部新增章节其中第四部新增章节9204 微生物鉴定指导原则。 微生物鉴定指导原则。 3 药典发布 检查法检查法 无菌检查法无菌检查法 非无菌产品微生物检查：微生物计数法非无菌产品微生物检查：微生物计数法 非无菌产品微生物检查：控制菌检查法非无菌产品微生物检查：控制菌检查法 抑菌效力检查法抑菌效力检查法 灭菌法灭菌法 指导原则指导原则 药品微生物检验替代方法验证指导原则药品微生物检验替代方法验证指导原则 微生物检查法应用指导原则微生物检查法应用指导原则 药品微生物实验室质量管理指导原则药品微生物实验室质量管理指导原则 微生物鉴定指导原则微生物鉴定指导原则 药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则 无菌检查用隔离系统验证指导原则无菌检查用隔离系统验证指导原则 4 微生物鉴定 微生物鉴定：指借助现有的分类系统，通过对未知微生 物的特征测定，对其进行分类的过程。 微生物鉴定：指借助现有的分类系统，通过对未知微生 物的特征测定，对其进行分类的过程。 细菌、酵母菌和霉菌大类的区分细菌、酵母菌和霉菌大类的区分 属、种及菌株水平的确定属、种及菌株水平的确定 门门 纲纲 目目 科科 属属 种种 关于鉴定的规定并非首次出现：关于鉴定的规定并非首次出现： 无菌检查法：若供试品管中任何一管显浑浊并确证有菌生长，判 供试品不符合规定，除非能充分证明试验结果无效：供试品管中 生长的微生物经鉴定后确证是因无菌试验中所使用的物品和（或 ）无菌操作技术不当引起的 无菌检查法：若供试品管中任何一管显浑浊并确证有菌生长，判 供试品不符合规定，除非能充分证明试验结果无效：供试品管中 生长的微生物经鉴定后确证是因无菌试验中所使用的物品和（或 ）无菌操作技术不当引起的 微生物限度检查法控制菌检查法：若平板上生长的菌落与表微生物限度检查法控制菌检查法：若平板上生长的菌落与表 格所列的菌落形态特征相符或疑似，应进行分离、纯化、染色镜 检和适宜的鉴定试验 格所列的菌落形态特征相符或疑似，应进行分离、纯化、染色镜 检和适宜的鉴定试验 微生物限度检查法应用指导原则：若供试品检出疑似致病菌，确 证的方法应选择已被认可的菌种鉴定方法，如细菌鉴定一般依据 伯杰氏细菌鉴定手册 微生物限度检查法应用指导原则：若供试品检出疑似致病菌，确 证的方法应选择已被认可的菌种鉴定方法，如细菌鉴定一般依据 伯杰氏细菌鉴定手册 5 微生物鉴定 药典通则中对检出微生物的鉴定做了明确的规定：药典通则中对检出微生物的鉴定做了明确的规定： 1106非无菌产品的微生物检查控制菌检查：选择培养基或指 示培养基上发现的疑似菌落需进行鉴定 非无菌产品的微生物检查控制菌检查：选择培养基或指 示培养基上发现的疑似菌落需进行鉴定 1101无菌检查法：阳性实验结果中分离的微生物进行鉴定，以判 定试验是否重试 无菌检查法：阳性实验结果中分离的微生物进行鉴定，以判 定试验是否重试 9205药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则：建议对洁净室药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则：建议对洁净室 和其他受控环境分离到的微生物进行鉴定，以掌握环境微生物污 染情况，有助于污染调查 和其他受控环境分离到的微生物进行鉴定，以掌握环境微生物污 染情况，有助于污染调查 生产中有时亦需对药物原辅料、制药用水、中间产物检出的微生 物进行适当水平的鉴定 生产中有时亦需对药物原辅料、制药用水、中间产物检出的微生 物进行适当水平的鉴定 6 微生物鉴定 7 微生物鉴定 微生物鉴定 微生物鉴定需达到的水平视情况而定，包括种、属鉴定 和菌株分型。 微生物鉴定需达到的水平视情况而定，包括种、属鉴定 和菌株分型。 大多数非无菌药品生产过程和部分无菌生产环境风险评估中，对 检出微生物进行常规特征（菌落形态、细胞形态、革兰染色、关 键生化反应）分析即可满足需要 大多数非无菌药品生产过程和部分无菌生产环境风险评估中，对 检出微生物进行常规特征（菌落形态、细胞形态、革兰染色、关 键生化反应）分析即可满足需要 非无菌产品的控制菌检查一般应达到种属的水平非无菌产品的控制菌检查一般应达到种属的水平 无菌试验结果阳性和无菌生产模拟工艺（如培养基灌装）失败时， 对检出的微生物鉴定至少达到种属水平，必要时需达到菌株水平 无菌试验结果阳性和无菌生产模拟工艺（如培养基灌装）失败时， 对检出的微生物鉴定至少达到种属水平，必要时需达到菌株水平 8 9 微生物鉴定 微生物鉴定根据所需达到的鉴定水平选择鉴定方法：微生物鉴定根据所需达到的鉴定水平选择鉴定方法： 表型微生物鉴定表型微生物鉴定 基因型微生物鉴定基因型微生物鉴定 必要时采用多种鉴定方法确定必要时采用多种鉴定方法确定 方法的局限性与数据库局限性息息相关：方法的局限性与数据库局限性息息相关： 未知菌鉴定是通过与微生物鉴定系统中的标准微生物（模式菌株） 的特征（表型和/或基因型）相匹配来完成的 未知菌鉴定是通过与微生物鉴定系统中的标准微生物（模式菌株） 的特征（表型和/或基因型）相匹配来完成的 10 微生物鉴定程序 微生物鉴定的基本程序包括分离纯化、初筛和鉴定：微生物鉴定的基本程序包括分离纯化、初筛和鉴定： 分离纯化分离纯化： -常用方法是挑取待测菌在适宜的固体培养基上连续划线，以获 取纯的培养物（单菌落），必要时可进一步进行纯培养以提供 足量菌体 常用方法是挑取待测菌在适宜的固体培养基上连续划线，以获 取纯的培养物（单菌落），必要时可进一步进行纯培养以提供 足量菌体 -从药物原辅料、制药用水、中间产物及终产品中检出的受损微从药物原辅料、制药用水、中间产物及终产品中检出的受损微 生物，可经分离纯化使其由不利生存状态转变为稳定状态生物，可经分离纯化使其由不利生存状态转变为稳定状态 1111 微生物鉴定程序 分离纯化应该使用环境监测的规定培养 基吗？ 分离纯化应该使用环境监测的规定培养 基吗？ 足量的营养保证能恢复微生物的理化状态：足量的营养保证能恢复微生物的理化状态： 基础培养基基础培养基：含有细菌生长繁殖所需的基本营养物质，可供大多 细菌生长 ：含有细菌生长繁殖所需的基本营养物质，可供大多 细菌生长 营养培养基营养培养基：在基础培养基中添加葡萄糖、富集因子等特殊成 分，供营养要求较高需特殊因子的细菌生长 ：在基础培养基中添加葡萄糖、富集因子等特殊成 分，供营养要求较高需特殊因子的细菌生长 微生物鉴定程序 初筛试验初筛试验：鉴定前确定待检菌的基本微生物特征，进行初 步分类。 鉴定前确定待检菌的基本微生物特征，进行初 步分类。 -革兰染色革兰染色/芽孢染色/芽孢染色 -镜检观察染色结果及细胞形态镜检观察染色结果及细胞形态 -氧化酶试验氧化酶试验：区分不发酵的革兰阴性杆菌和肠道菌：区分不发酵的革兰阴性杆菌和肠道菌 -过氧化氢酶试验过氧化氢酶试验：区分葡萄球菌和链球菌：区分葡萄球菌和链球菌 -凝固酶试验：区分凝固酶阳性致病葡萄球菌和凝固酶阴性非致 病葡萄球菌 凝固酶试验：区分凝固酶阳性致病葡萄球菌和凝固酶阴性非致 病葡萄球菌 12 微生物鉴定程序 革命性的革兰染色方案全自动革兰氏染色仪：革命性的革兰染色方案全自动革兰氏染色仪： 全面自动：替代手工染色过程的初染、媒染、复染各步骤，从样 本固定到染色干燥全面自动完成 全面自动：替代手工染色过程的初染、媒染、复染各步骤，从样 本固定到染色干燥全面自动完成 品质保证：特别设计的雾化喷嘴，配合高品质的染液，极力降低 假阳性及假阴性 品质保证：特别设计的雾化喷嘴，配合高品质的染液，极力降低 假阳性及假阴性 灵活溯源：染液及玻片均可扫码追溯，并对机载染液量进行连续灵活溯源：染液及玻片均可扫码追溯，并对机载染液量进行连续 追踪追踪 13 清洁安全：液晶触摸屏操作，自动清洁， 全程避免染液接触试验人员 清洁安全：液晶触摸屏操作，自动清洁， 全程避免染液接触试验人员 表型微生物鉴定 依据表型特征（菌落形态、理化特征、化学成分）的表 达区分微生物的差异，是经典的分类鉴定法。 依据表型特征（菌落形态、理化特征、化学成分）的表 达区分微生物的差异，是经典的分类鉴定法。 分类分类特征特征 培养物培养物菌落形态、菌落颜色、形状、大小和产色素菌落形态、菌落颜色、形状、大小和产色素 形态学形态学 细胞形态/大小/形状、鞭毛类型、内容物、革兰染色、细胞形态/大小/形状、鞭毛类型、内容物、革兰染色、 芽孢/抗酸染色、孢子形成模式芽孢/抗酸染色、孢子形成模式 生理学生理学氧气耐受性、氧气耐受性、pH范围、最适温度和范围、耐盐性范围、最适温度和范围、耐盐性 生化反应生化反应碳源利用、糖类氧化/发酵、酶的模式碳源利用、糖类氧化/发酵、酶的模式 抑制性抑制性胆盐耐受性、抗生素敏感性、染料耐受性胆盐耐受性、抗生素敏感性、染料耐受性 血清学血清学凝集反应、荧光抗体凝集反应、荧光抗体 化学分类化学分类脂肪酸构成、微生物毒素、全细胞组分脂肪酸构成、微生物毒素、全细胞组分 生态学生态学微生物来源微生物来源 14 表型微生物鉴定 微生物表型的表达，除受 遗传基因控制外，还与分 离环境、培养基和生长条 件等因素有关。 微生物表型的表达，除受 遗传基因控制外，还与分 离环境、培养基和生长条 件等因素有关。 表型微生物鉴定常需要大 量的纯培养物，一些从初 始培养物中刚分离出的受 损微生物还不能完整地表 达其表型属性。因此应注 意采用的培养基、培养时 间和传代次数。 表型微生物鉴定常需要大 量的纯培养物，一些从初 始培养物中刚分离出的受 损微生物还不能完整地表 达其表型属性。因此应注 意采用的培养基、培养时 间和传代次数。 15 16 表型微生物鉴定 手工微生物鉴定系统：手工微生物鉴定系统： 广泛认可广泛认可： -自自1969年以来，被广大微生物学实验室所采纳，并沿用至今年以来，被广大微生物学实验室所采纳，并沿用至今 -被众多科学文献著作及新兴方法奉为分类参照的被众多科学文献著作及新兴方法奉为分类参照的金标准金标准 使用便捷使用便捷： -同一试条系统内可同时检测氧 气的耐受性、酶促反应、碳源 利用能力、糖类氧化/发酵等 多种表型特征 同一试条系统内可同时检测氧 气的耐受性、酶促反应、碳源 利用能力、糖类氧化/发酵等 多种表型特征 -测试小杯中的干燥底物复溶形 成微反应体系 测试小杯中的干燥底物复溶形 成微反应体系 -涵盖制药业客户常见的环境细 菌及真菌 涵盖制药业客户常见的环境细 菌及真菌 手工微生物鉴定系统：手工微生物鉴定系统： 与时俱进与时俱进： -数据资料库是整套系统的心脏，在线运算使得结果显示有更大 的可能性 数据资料库是整套系统的心脏，在线运算使得结果显示有更大 的可能性 表型微生物鉴定 17 -用户可购买拥有用户可购买拥有5年使用权的 登录账号 年使用权的 登录账号 历久弥新历久弥新： -进行了数据库和算法的全面升 级（最新版本 进行了数据库和算法的全面升 级（最新版本3.1） -制药业用户需一系列的文件更 迭：软件及服务器认证文件、 制药业用户需一系列的文件更 迭：软件及服务器认证文件、 apiweb的设计控制文件、更新 的 的设计控制文件、更新 的ISO系统认证系统认证 18 表型微生物鉴定 全自动微生物鉴定及药敏系统：全自动微生物鉴定及药敏系统： 基于金标准原理衍生出的全自动化系统，替代人工完成菌液配制、 试卡接种、孵育培养与结果判读 基于金标准原理衍生出的全自动化系统，替代人工完成菌液配制、 试卡接种、孵育培养与结果判读 更全面的鉴定项目：除了按照传 统的革兰氏染色结果设置鉴定分 更全面的鉴定项目：除了按照传 统的革兰氏染色结果设置鉴定分 类，更针对制药业客户开发类，更针对制药业客户开发BCL、 CBC试卡试卡 更适合的系统功能：极其简单直 观的可视化系统，协助用户轻松 储存及管理鉴定结果，针对制药 业客户的需求还可选择开通 更适合的系统功能：极其简单直 观的可视化系统，协助用户轻松 储存及管理鉴定结果，针对制药 业客户的需求还可选择开通SRF、 21CFR11等功能等功能 系统名称 自动化程度 系统名称 自动化程度 菌悬液配制菌悬液配制 试条/试卡 接种 试条/试卡 接种 培养条件培养条件判读分析判读分析 手工 手工比浊管手工加样自主孵育 肉眼判读 软件数据库 分析 自动 电子比浊仪 DENSIMAT 电子连续 加样枪 自主孵育 数读仪判读 软件数据库 分析 全自动 电子比浊仪 DensiCHEK Plus 仪器整合的 充填仓 仪器整合的 培养箱 仪器整合阅读 软件数据库 高级报告工具 表型鉴定全面解决方案：表型鉴定全面解决方案： 19 表型微生物鉴定 20 表型微生物鉴定 目前已有的鉴定方法多基于生化反应和 碳源利用特征，新兴方法包括： 目前已有的鉴定方法多基于生化反应和 碳源利用特征，新兴方法包括： 气相色谱法：分析微生物的脂肪酸特征气相色谱法：分析微生物的脂肪酸特征 MALDI-TOF MS法法：分析微生物蛋白等：分析微生物蛋白等 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱 核糖体蛋白指纹图谱鉴定系统 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱 核糖体蛋白指纹图谱鉴定系统 21 表型微生物鉴定 堪称表型鉴定的终极方法：堪称表型鉴定的终极方法： 灵活易用：标品可来源于临床、食 品、洁净环境等，对标本状态、菌 龄要求不高，实验人员可灵活安排 工作 灵活易用：标品可来源于临床、食 品、洁净环境等，对标本状态、菌 龄要求不高，实验人员可灵活安排 工作 准确可靠：超强性能，系统对图谱准确可靠：超强性能，系统对图谱 具有高分辨力具有高分辨力 快速简便：手工操作极其简便（挑 取菌落、点板、加基质液），上机 后仅需 快速简便：手工操作极其简便（挑 取菌落、点板、加基质液），上机 后仅需45-90秒即可得到一个结果秒即可得到一个结果 节约环保：除了基质靶板节约环保：除了基质靶板2种耗材及 实验室配置的接种环、加样枪头， 无需其他投入，降低了平均成本； 产生的生物垃圾少 种耗材及 实验室配置的接种环、加样枪头， 无需其他投入，降低了平均成本； 产生的生物垃圾少 2222 表型微生物鉴定 霉菌鉴定系统霉菌鉴定系统 分类分类蛋白组学蛋白组学 鉴定原理鉴定原理 MALDI-TOF MS 数据库大小数据库大小 80种真菌及种真菌及80 种酵母菌 （第 种酵母菌 （第4版本）版本） 数据库类型数据库类型专利专利 常见表型及基因型霉菌鉴定 方法及数据库的比较 常见表型及基因型霉菌鉴定 方法及数据库的比较 23 表型微生物鉴定 表型微生物鉴定已广泛应用于药品微生物实验室。根据 适当比例的鉴定信息可掌握环境微生物菌群的变化并进 行风险评估，也可帮助调查人员进行污染调查并制定纠 正措施。 表型微生物鉴定已广泛应用于药品微生物实验室。根据 适当比例的鉴定信息可掌握环境微生物菌群的变化并进 行风险评估，也可帮助调查人员进行污染调查并制定纠 正措施。 定性趋向性定性趋向性： -具重复性的结果（不断重复出现的微生物种类）是一个有效合具重复性的结果（不断重复出现的微生物种类）是一个有效合 理的环境监测的关键理的环境监测的关键 定量趋向性定量趋向性： -警戒水平警戒水平：对于来自正常操作条 件下的潜在风险的警告，需要对 潜在的问题继续跟进 ：对于来自正常操作条 件下的潜在风险的警告，需要对 潜在的问题继续跟进 -行动水平行动水平：当超过了这个水平， 便会引发一个调查及基于该调查 而采取的措施 ：当超过了这个水平， 便会引发一个调查及基于该调查 而采取的措施 基因型微生物鉴定 微生物基因型通常不受培养基和分离环境的影响。微生物基因型通常不受培养基和分离环境的影响。 涉及的方法很多：涉及的方法很多： DNA-DNA杂交杂交 DNA探针探针 限制性酶切片段图谱（限制性酶切片段图谱（Southern杂交）杂交） 16S rRNA序列序列 18S rRNA序列序列 多位点序列分型多位点序列分型 聚合酶链反应聚合酶链反应 焦磷酸测序焦磷酸测序 核糖体分型分析核糖体分型分析 24 25 基因型微生物鉴定 基因型鉴定法不但技术水平要基因型鉴定法不但技术水平要 保证，还需昂贵的分析设备和保证，还需昂贵的分析设备和 实验条件实验条件（提取、扩增、杂交、（提取、扩增、杂交、 测序）测序） 通常仅适合在关键微生物调查 中使用（如产品的不合格调查） ，若使用方法必须经过确认 通常仅适合在关键微生物调查 中使用（如产品的不合格调查） ，若使用方法必须经过确认 微生物鉴定指导原则微生物鉴定指导原则 基因型微生物鉴定是否适合作为基因型微生物鉴定是否适合作为QC部门 普及的检测方法？ 部门 普及的检测方法？ 26 微生物鉴定方法的确认 方法确认方法确认 确认（确认（Validation）：对产品的各项相关事项作出科学性的评价 及书面记录的过程 ）：对产品的各项相关事项作出科学性的评价 及书面记录的过程 验证（验证（Qualification）：为确认的一个环节，目的是保证仪器在 使用的过程当中，符合原设计的要求并达到原拟的目的，亦即产 生可信赖的量测结果 ）：为确认的一个环节，目的是保证仪器在 使用的过程当中，符合原设计的要求并达到原拟的目的，亦即产 生可信赖的量测结果 鉴定方法供应商和用户协作完 成， 鉴定方法供应商和用户协作完 成，QA、QC部门均参与部门均参与 微生物鉴定方法的确认 鉴定系统的确认试验按鉴定系统的确认试验按下述方法之一下述方法之一 进行：进行： 采用现有方法和待确认方法对日常检验中 分离的微生物约 采用现有方法和待确认方法对日常检验中 分离的微生物约50株进行平行鉴定试验， 结果的差异使用仲裁方法判定 株进行平行鉴定试验， 结果的差异使用仲裁方法判定 使用使用12-15种已知的能代表常规分离到的 微生物的储备菌种，共进行 种已知的能代表常规分离到的 微生物的储备菌种，共进行50次鉴定试验次鉴定试验 待确认方法对待确认方法对20-50株微生物（包括株微生物（包括15-20 个不同的种）进行鉴定，结果与参照实验 室的鉴定结果一致 个不同的种）进行鉴定，结果与参照实验 室的鉴定结果一致 27 鉴定方法的确认注定是一个漫长而繁复 的过程？ 鉴定方法的确认注定是一个漫长而繁复 的过程？ 微生物鉴定方法的确认 准确性准确性%（结果正确的数量/总的结果数量）（结果正确的数量/总的结果数量）100 重现性重现性%（结果正确且达到一致性的数量/总的结果数量）（结果正确且达到一致性的数量/总的结果数量） 100 用户考虑鉴定方法的适用性，应建立准确性和重现性接受标准用户考虑鉴定方法的适用性，应建立准确性和重现性接受标准 28 确认试验所用的菌株应包括确认试验所用的菌株应包括鉴定方法 供应商 鉴定方法 供应商和和药典推荐药典推荐的适宜质控菌株的适宜质控菌株 合适的鉴定系统，还应考虑其一致性 水平：试验菌株与模式微生物的一致 性水平通常应大于 合适的鉴定系统，还应考虑其一致性 水平：试验菌株与模式微生物的一致 性水平通常应大于90% 微生物鉴定方法的确认应包括微生物鉴定方法的确认应包括准确性准确性、 专属性、 、 专属性、重现性重现性、灵敏性、阳性预测 值、阴性预测值 、灵敏性、阳性预测 值、阴性预测值 微生物鉴定方法的确认 其他测定值：其他测定值： 准确性准确性(AD)/100100% 灵敏（包容）性灵敏（包容）性A/(AB)100% 专属（排除）性专属（排除）性D/(CD)100% 阳性预测值（阳性预测值（PPV）A/(AC)100% 阴性预测值（阴性预测值（NPV）D/(BD)100% 分析准确度分析准确度(AD)/(ABCD)100% Kappa系数系数2(ADBC)/(AC)(CD)(AB)(BD) 100 参照“金标准”方法参照“金标准”方法 阳性阳性阴性阴性 所确认的 新方法 所确认的 新方法 阳性阳性AC 阴性阴性BD 29 溯源分析 菌株水平的鉴定非常重要：菌株水平的鉴定非常重要： 在在污染调查污染调查过程中，尤其是产品中的微生物数量高于建议水平或 出现异常高的微生物检出情况时 过程中，尤其是产品中的微生物数量高于建议水平或 出现异常高的微生物检出情况时 在在无菌工艺无菌工艺中，尤其是无菌试验结果阳性和培养基灌装等模拟工 艺失败时 中，尤其是无菌试验结果阳性和培养基灌装等模拟工 艺失败时 污染调查等应以基因型特征鉴定为主，表型特征鉴定为 辅。 污染调查等应以基因型特征鉴定为主，表型特征鉴定为 辅。 同一地点同种菌表型和基因型特征是基本一致的同一地点同种菌表型和基因型特征是基本一致的 不同地点的同种菌表性特征可能基本一致，但保守及可变区域的 基因特征会有一定的差异 不同地点的同种菌表性特征可能基本一致，但保守及可变区域的 基因特征会有一定的差异 溯源过程中为确保微生物为完全相同的菌株，需比对更 多的特征基因序列及片段，甚至是全基因组，如此可实 现既鉴定又溯源的目的。 溯源过程中为确保微生物为完全相同的菌株，需比对更 多的特征基因序列及片段，甚至是全基因组，如此可实 现既鉴定又溯源的目的。 30 溯源分析 常见的溯源分析技术：常见的溯源分析技术： 31 分类分类方法方法特征及优缺点特征及优缺点 早期 方法 早期 方法 质粒质粒DNA 图谱图谱 操作相对简单只需要精简的设备，费用低廉；但 质粒自发的丢失获取及转移造成图谱不稳定性， 也无法区分序列不同的质粒 操作相对简单只需要精简的设备，费用低廉；但 质粒自发的丢失获取及转移造成图谱不