细胞周期及其调控(讲义)

医学分子细胞生物学,细胞周期及其调控CellCycleATM基因是AT唯一致病基因；对AT纯合子突变细胞的研究表明，这类突变细胞缺乏细胞周期检查点调控对辐射损伤的正常反应，缺乏辐射诱导P53蛋白增加、p21wAFl和Gadd45转录和翻译水平增强的动态变化，表明ATM很可能是DNA损伤反应途径中p53的上游分子。,ATM（ataxiatelangiectasia-mutatedgene）最早发现于毛细血管扩张性共济失调症患者，人类中大约有1%的人是ATM缺失的杂合子，表现出对电离辐射敏感和易患癌症。ATM编码蛋白激酶，与损伤DNA结合，信号通路有两条:激活Chk1（checkpointkinase）,使cdc25的Ser216磷酸化失去活性，抑制M-CDK的活性，中断细胞周期。激活Chk2，使P53被磷酸化而激活，然后P53作为转录因子，导致P21的表达，P21抑制G1-S期CDK的活性，中断细胞周期。,(3)P16INK4aP16INK4a基因位于人类染色体9p21区，编码由148个氨基酸组成的分子量为16kD蛋白质。P16INK4a与周期蛋白D1竞争性结合G1期激酶CDK4CDK6，抑制其对pRB的磷酸化作用，使游离的E2F-1与未磷酸化的PRB结合，依赖于E2F-1转录的基因不能转录，P16INK4a间接抑制包括DNA合成在内的多种生化反应，使细胞周期正常运行。,（4）pRBpRB的去磷酸化在M及s期由蛋白磷酸酶1催化进行。在周期蛋白CDK复合物与蛋白磷酸酶1的协同作用下，pRB的磷酸化去磷酸化之间的动态平衡有效控制着G1限制点的“开启和关闭”，从而保证细胞周期的有序运行及细胞的正常增殖。,生长因子与相应受体结合,通过信号传递促进cyclin基因表达；cyclin与相应的CDK结合为激酶复合物对pRb进行磷酸化；磷酸化的pRb释放其结合并抑制的蛋白,主要是转录因子E2F以及具激酶活性的CAB-1蛋白等；游离的E2F进入核内,与多种具特殊序列的基因启动子区结合(如c-myc、b-myb、cdc2、二氢叶酸还原酶、TK及E2F-1基因等),促进这些基因的表达；这些基因的产物促进细胞通过G1/S调控点.CKI通过抑制cyclin-CDK激酶活性,使pRb不能磷酸化,pRb仍与E2F结合,E2F则不能进入核内发挥转录作用,使细胞停滞于G1期.,G1/S调控点以pRb为中心构成一个复杂网络的共同模式,细胞周期长短测定,脉冲标记DNA复制和细胞分裂指数观察测定法流式细胞仪测定法(FlowCytometry)缩时摄像技术，可以得到准确的细胞周期时间及分裂间期和分裂期的准确时间。,细胞周期同步化1,人工选择同步化（药物诱导法）条件依赖性突变株在细胞周期同步化中的应用：将与细胞周期调控有关的条件依赖性突变株转移到限定条件下培养，所有细胞便被同步化在细胞周期中某一特定时期。,人工选择同步化2有丝分裂选择法：用于单层贴壁生长细胞。优点：细胞未经任何药物处理，细胞同步化效率高。缺点：是分离的细胞数量少。密度梯度离心法：根据不同时期细胞在体积和重量上存在差别进行分离。优点：方法简单省时，效率高，成本低。缺点：对大多数种类的细胞并不适用。,药物诱导法（DNA合成阻断法）G1/S-TdR双阻断法：将细胞群阻断于G1/S交界处。优点：同步化效率高，适合所有体外培养细胞体系。缺点：是诱导过程可造成细胞非均衡生长。分裂中期阻断法通过抑制微管聚合来抑制细胞分裂器的形成，将细胞阻断在细胞分裂中期。优点：是操作简便，效率高。缺点：是这些药物的毒性相对较大。,第三节DNA受损阻止细胞周期的分子学说,一、DNA损伤的后果:,信号传导异常,长期效应,老化,肿瘤,疾病,DNA修复机制,短期效应,异常增生和代谢,生理功能紊乱,细胞死亡,细胞增殖减少,基因表达异常,基因组不稳定,哺乳类动物的细胞周期检查点控制机制,二、细胞衰老的理论（一）基因转录或翻译差错、代谢废物积累；（二）ROS引发脂质、蛋白质和核酸分子氧化性损伤；（三）端粒钟学说（telomereclocktheory)（四）衰老基因与抗衰老基因1.衰老基因人类：载脂蛋白E4基因、淀粉样蛋白基因p16,p53p21RB基因2.抗衰老基因WRNbcl-2,CDK22，cyclinA、B和c-fos表达下降,不能是Rb磷酸化,E2F与Rb结合，从而不能发挥转录作用,细胞不能进入S期,细胞进入S期,生长因子,（二）细胞衰老的生化变化DNA复制、转录、修复能力端粒长度DNA甲基化DNA/chromosome损伤2.mRNA与核糖体结合能力蛋白质合成能力3.蛋白质分子损伤，功能酶活性,第四节细胞周期与疾病,一、癌与细胞周期癌基因(oncogene):能促使细胞无限增殖、癌变的DNA序列。分若干基因家族（已发现近百种癌基因）抑癌基因（suppression-oncogene)：存在于正常细胞中、能抑制细胞恶性增殖的基因。,1细胞周期驱动机制失控Cyclins的过表达（Overexpressionofcyclins）肿瘤的发生与cyclin（D、E）过量表达有关。CyclinD1（Bcl-1）过表达原因（原癌基因）乳腺癌、胃癌、食道癌存在CyclinD1基因扩增过度。,基因突变:CyclinD1T286突变CyclinD1泛素化受阻CyclinD1,染色体倒位（Chromosomeinversion）CyclinD1基因倒位于甲状旁腺启动子控制，CyclinD1蛋白合成染色体易位（Chromosometranslocation)甲状旁腺腺癌Bcl-1t(11:14)(q13:q32)易位CyclinD1受Ig重链基因增强子影响CyclinD1表达,CDK表达异常主要见于CDK4、CDK6过表达。CDK4+cyclinD结合CDK4/cyclinDCDKs表达pRbpRb磷酸化细胞增殖过度E2FG1/S过渡加速,【CyclinD过表达致肿瘤机制】CyclinD过表达+生长因子CDKs瀑布效应细胞增殖过度易发生细胞癌变,可能,CDI表达不足和突变肿瘤细胞中常出现CDI（肿瘤抑制基因）表达不足或突变。p16InK4基因失活原因突变或缺失、染色体易位、p16InK4高度甲基化。,Mechanismp16InK4基因表达CDK4与cyclinD结合细胞周期处在“易于”被启动状态易发生细胞癌变,G1/S交界处失察P53进入S期DNA损伤修复成功G1/S检查停顿G1期损伤DNA修复修复失败细胞凋亡下调bcl-2表达、激活bax基因P53,表2人类肿瘤p53基因突变热点和频率肿瘤型突变频率（%）突变热点肿瘤型突变频率（%）突变热点肺癌56157，248，273前列腺癌30不确定结肠癌50175，245，248，273肝细胞癌45249食道癌45不确定胶质癌25175、248卵巢癌4427