左旋肉碱的制备方法

第 3 7卷第 3期 2 0 0 8年6月 当 代 化 工 Co n t e mp o r a r y Ch e mi c a l I n d us t r y V0 l I 3 7 N o 3 J u n e ， 2 0 0 8 左 旋 肉碱 的 制 备 方 法 术 张凤清， 张丽君， 周长民 ( 沈阳产 品质量监督检验院 ， 辽 宁 沈 阳 1 1 0 0 2 2 ) 摘 要： 综述了左旋肉碱的来源，生理功能以及其作为生理活性成分的应用情况和几种合成 左旋肉碱的方法。 关键词 ： 左旋 肉碱 ； 应用 ； 制备 中图分类号： T S 2 0 1 2 文献标识码： A 文章编号： 1 6 7 1 0 4 6 0 ( 2 0 0 8 ) 0 3 0 3 1 6 0 3 L 一肉碱 ，又称 肉毒碱 ，化学名称 8一羟基 一 V一 三甲铵丁酸， 是一种白色晶状体或白色透明 细粉 ， 在水 、 酒精 、 碱溶液 中高度溶解 ， 2 0 0以上 分解熔化， 左旋肉碱( L e v o c a r n i t i n e ) 在脊椎动物 和无脊动物组织中普遍存在， 也存在于一些植物 和微生物中。1 9 0 5 年 ， 俄国的 G u l e w i t s c h和 Kr i m b e r g从肉抽提物中发现了肉碱_ 1 J 。 1 9 2 7年， T o mi t a 和 S e n d j u证实 了其分 子结构 为 L 一 3 一羟基 一 4 一 三 甲铵 丁 酸 ( L p H y d r o x y 一 一 B u t y r o b e t a i n e ) 。 1 9 4 8年 ， F r a e n k e l 发现了大黄粉虫幼虫的生长需 要一种生长因子 ， 并将此命名为维生素 B T 。1 9 5 2 年 ， C a r t e r 确证 了维生素 B T就是肉碱 。从 1 9 5 3 年 开始 ， 左旋 肉碱列 在美 国 化学 文摘 中 V i m m i n B T的索引栏 目 下。 1 9 5 8 年， F r i t z 发现左旋肉 碱能加速细胞( 线粒体 ) 对脂肪 的消耗 ， 确定 了左 旋肉碱对人体脂肪酸氧化的重要作用。1 9 7 3年 ， E n g e l 报道首例肉碱缺乏症病例， 并用肉碱治疗。 2 O世纪 8 O年代 肉碱作为商品在国外上市 ，并被 收入美 国药典 2 2版。肉碱和许多生物活性分子 一 样有两种形式： 左旋 肉碱和右旋肉碱 ， 前者具有 生理活性 ， 后者是其竞争性抑制剂 ， 美 国 F D A于 1 9 9 3 年禁止销售右旋和混旋型肉碱。1 9 9 6 年， 在 我国的第 1 6次全国食品添加剂标准化技术委员 会上通过 ， 允许在饮料 、 乳饮料 、 饼干 、 固体饮料 、 乳粉 中使用左旋肉碱 。 1 左旋 肉碱的合成方法 由于左旋 肉碱广泛应 用于食品 、 饲料 、 医疗 等领域 ， 当前， 世界上许多国家都在研究左旋肉 碱的生产方法 ， 并取得 了一定的进展。 1 1 化学合成法 这是最早的生产 肉碱的方法。但 由于不能将 L 一型和 D一型分开 ， 而 D一型又有负作用 ， 一般禁 止使用。 故将 L 一 型和D 一 型拆分是现在使用的一 种方法 ， 但 由于该法操作复杂 ， 产 品得率低 ， 且拆 分剂价格昂贵 ， 难以实现工业化生产 。 1 2 基因重组技术法 左旋 肉碱应用于食品和保健食 品 ， 目前 的市 场 占有率还很小 ， 具有很大的市场潜力 。国内卫 生部受理批准的保健食品有 3 O类、 1 5 4 1 种 ， 其 中肉碱类的保健食 品仅有 9个 品种 ，占 0 5 8， 品种很少 ， 市场占有率很低。根据保健食品功能 因子被认知的程度，第 1 代占3 2 9 ( 功能因子 不 明确 ) ； 第 2代 占 2 1 7 4( 补充各种营养素 、 强 化食品 ) ； 第 3 代 占4 6( 确知功能因子 、 化学结 构和含量) 。左旋肉碱是可以大力开发的第 3 代 保健食品。近年来 ， 我 国人群的亚健康状态呈上 升趋势 ， 糖尿病、 脂肪肝 、 心血管病 、 肿瘤发病率 上升， 说明现代人的生活方式 、 饮食结构均需要 更加科学和合理调摄 ， 而营养的平衡 、 人体必需 的营养素的补充是必不可少的。左旋肉碱是脂肪 收稿 日期 ： 2 0 0 7 - 1 2 2 4 修订 日期 ： 2 0 0 8 0 2 - 0 2 作者简介 ：张凤 ( 1 9 6 5 一 ) ， 女， 辽宁大连人， 高级工程师， 1 9 8 7年毕业于沈 阳化工学院化学工程与工艺专业， 现从事食 品检验专业。 电子 邮箱 ： z h a n g f q 1 9 6 5 1 2 6 c o m，电话 ： 0 2 4 2 5 8 9 3 2 3 6 。 维普资讯 2 0 0 8年 6月 张凤清， 等： 左旋肉碱的制备方法 3 1 7 代谢的必需辅助因子， 从饮食途径外源性补充左 旋肉碱， 在人们健康观念更新的今天， 将左旋肉 碱应用于与人们生活密切相关的食品领域具有 很好的发展前景。左旋肉碱作为新型机能性添加 剂 已得到广泛应用 ， 不但用 于食 品上 ， 而且在饲 料和医疗方面也有应用， 具有非常广阔的市场前 景。目前只有 日 本、 瑞士、 意大利等国能够生产， 国内需求全靠进 口， 亟待国内科研人员投人该项 目的研究工作 ， 以填补国内空 白。 1 3 直接提取 左旋 肉碱在食物 中的含量见表 l 。 表 1 左旋肉碱在各种食物中的含量闭 Ta bl e 1 T h e c o n t e n t o f L- c a r n i fi n e i n s o me f o o d s 可见， 在动物肌肉中左旋肉碱的含量相对较 丰富， 早期的左旋肉碱往往是从肉浸膏中分离出 来但 由于左旋 肉碱的绝对含量较少 ， 且有结构类 似物 的存在 ， 难 以分离 ， 因而提取纯化 的步骤较 多， 得率低， 不适合工业化生产。 1 4 消旋体拆分 肉碱最初是以混旋的形式出现的， 美国专利 3 1 3 5 7 8 8和 4 0 7 0 3 9 4是两种典型的制备混旋 肉碱 的方法 ， 后来人们发现了右旋肉碱所产生的不利 影响， 开始对混旋物进行拆分。 1 4 1 化学拆分 美国专利 3 l 5 1 1 4 9 报道了使用D一( + ) 一樟 脑 一 l 0 一磺酸进行拆分 ，但此方法要使用 Ag NO， 以除去 c I 一 ， 因而成本高 ， 收率低( 小于 5 0 ) ， 纯 度低( A 存在) ， 生产条件苛( A g C 1 见光使生 产容器变黑) 。李全等人研究了左旋肉碱盐酸盐 新的合成方法， 以氯乙酸乙酯为起始原料， 经过 格氏反应 ， 还原 ， 铵化 ， 水解及拆分等五步反应 ， 合成了产物， 优点是避开了有毒的氰化物和氯化 汞 ， 且无需离子交换树脂 ， 操作安全 ， 简便 3 。 1 4 2 生物拆分 利用微生物专一降解右旋肉碱的能力生产 左旋肉碱。C h a r l e s 在此方面作了很多工作 ， 选育 出降解右旋肉碱有特效的菌株 ， 经过 2 5， 4 4 h 的培养， 右旋肉碱全部消失， 左旋肉碱剩下 3 8 4 ， 由此可见， 尽管纯度很高， 但得率实在太低。 1 5 右旋肉碱 的再利用 通过消旋处理得到的右旋肉碱在以前是作 为废物处理的 ，但 Gi a n n e s s i 发 明了一个专利 ， 从 右旋肉碱出发， 经酰化 ， 酸水解 ， 内酯化， 水解 ， 再 通过离子交换柱， 将 Me S O 2C加上， 然后在 N a zC O ， 水溶液中搅拌得到左旋 肉碱【 5 J 。 1 5 1 加人脱氢肉碱 在 由 4 0单位 的肉碱脱 氢酶 ， NA D+ 2 mM， 甲 酸脱氢酶 4 0单位 ， H C O zN I-L l 5 0 m M，磷酸 5 0 mM( p H 7 5 ) ， 氯霉素 6 mg 5 0 mL组成 的混合液 中以一定 的速度加人脱 氢 肉碱盐酸盐 0 8 M， 甲 酸 0 8 M。加完料后将温度调整到 3 0， 加人 2 M N H 4 O H将 p H调整到 7 0 。经过 7 0 h ，获得 l 0 3 g 左旋肉碱， 得率高达 9 6 问 。 但这种方法必 须利用昂贵的辅酶N A D H， 只适合于实验室操作。 1 5 2 加人 巴豆甜菜碱 巴豆甜菜碱是生物合成 L 一肉碱 的前体物 质。微生物 中的细菌、 放线菌 、 酵母菌和霉菌都有 能水解合成 L 一肉碱 的菌株 ，目前 国内外研究者 最多。在国内， 江苏省微生物研究所的研究结果 为： 酶转化产 L 一肉碱 5 g L ， 转化率 4 0 ， 由于可 以利用拆分废物作原料， 大大降低了成本 。这是 一 种很有潜力的方法。 1 5 _ 3 从 一丁基甜菜碱出发 一 丁 。 基甜菜碱是合成 L 一肉碱 的直接前 体 ， 可以用酶法羟化而制得， 但 由于丁基甜菜碱 价格昂贵， 因此 ， 限制了这种方法的大规模生产。 1 6 不对称合成 这是指只合成二个光学异构体中的一个的 方法 。 Ki t a mu r a报导 ， 3 5 M 的氯乙酰乙酸乙酯醇溶 液在 R u ( O CO C H3 ) ： 和 R u X ： ( X=C 1 ， B r ) 的催化 下， 反应条件为 1 0 M P a ， 1 0 0 ， 通人氢气， 5 m i n 后 反应结束，得到光学纯度为 9 7 的左旋肉碱中间 体， 这种方法简便， 快速， 纯度高， 但反应条件苛刻 圈 。Mc c a h y发明了一种更简单的方法 ，就是 以 ( s ) 一 3 一羟丁酸 内酯为原料 ，只经过两步反应 ， 直 接得到左旋 肉碱 ， 光学纯度高达 9 5 嘲 。 C h o o n g以 维普资讯 3 1 8 当 代 化 工 第3 7卷第 3期 很容易获得的原料 C H ： C O和C 1 C C HO出发 ， 经过 一 系列反应 碍到左 旋肉碱的立体专 一 I生 的中间体砌 。 1 7 生物化学方法 ( 1 ) 用化学方法合成原料 ，如采用格氏反应 得氯代乙酰乙酸酯。 ( 2 ) 用生物方法得到能合成左旋 肉碱 的具有 立体专一l生的中间产物。刘红霞利用 4 种不同的酵 母对乙酰乙酸乙酯进行还原实验发现 ：所需反应 条件温和 ； 反应物质简单 ； 操作简单 ； 立体选择性 高， 光学纯度分别为8 3 1 、 8 3 7 、 9 3 5 、 9 8 8 t“ 】 。 周炳南对 C 1 C H 2 C O C H2 C OO ( C H 2 ) n H的各 种醇的酯进行了深入研究， 找到了一条 4 一氯代 一B 酮酸不 同链长的酯与酵母还原产物光学 活性 的 关系曲线 。 从这条曲线可以发现： 随着醇链的增长 R型成份增；0 1 t 。 Ba r e 作 了这方面的详细工作 ， 他 用 自由状态下的酵母细胞进行单相的生物转化 ， 6 h 后 9 0 的氯乙酰乙酸辛酯被还原。用自由状 态下的酵母细胞进行双相生物 转化 ， 4 8 h后氯 乙 酰乙酸辛酯还原率是 8 5 t ” 】 。A r a v a mu d a n报导 ， 节杆菌 ( A r t h r o b a c t e r s p AT C C 1 9 1 4 0 ) 和棒状杆菌 ( C o r y n e b a c t e r i u m e q u i I F O一 3 7 3 0 )也具有专一还 原性 ， 可分别得到光学纯度为 6 9 和 9 7 的左旋 肉碱的中间体 。C h a r l e s 在他 的一篇专利 中 【 4 提 出 ， 有 2 2种酵母菌和 2 5种真菌具有此种还原功 能 ， 在另一篇专利 中【 旧， 他 明确提出， 在这些微生 物中起作用 的是 L B一羟基酰基辅酶 A还原酶 E C 1 1 1 3 5 。 ( 3 ) 将具有立体专一性的中间产物合成左旋 肉碱 以乙醇为溶剂， 将具有立体专一性的中间产 物与三甲胺在 8 0下反应 ， 随后用 3 N HC 1 还原 2 h ， 最后得到左旋 肉碱 的结 晶， 整个过程的得率 可 达 4 5 。 2 结束语 L 一肉碱是人类及动物必需的营养物质 ， 是类 维生素营养素 ， 相当于维生素 B族( 维生素 B T ) 。 它是一种与动物体内脂肪酸代谢有关的化合物 左旋肉碱作为载体以脂酰肉碱的形式将长链脂 肪酸从线粒体膜外运送到膜内， 起到促进脂肪酸 B一 氧化的作用【 q ； 左旋肉碱作为载体将过量的 脂酰 C o A E 出体外， 避免细胞内过量积累内源I生 或 外源性脂酰C o A， 从而防止代谢l生 酸中 毒的产生【刀 ； 左旋肉碱通过增加与尿素的结合 促进体内氨的 排出， 解除氨的毒性 ， 氨是蛋白质降解的副产物 ， 是运动后致疲劳的主要因素之一， 即使是低剂量 也有相当的毒性 ； 左旋肉碱能有效地降低运动后 血中乳酸浓度， 从而可使运动员从疲劳中J陕速恢复。 参 考 文 献 1 赖卫华 ， 许杨 ， 陆豫 左旋 肉碱 的生理 功能 、 应用 及其制备 J 食 品工业科技 ， 1 9 9 8 ， ( 6 ) ： 7 5 2 刘武肉碱的生物学新功用 J 生命的化学 ， 1 9 9 1 ， 1 1 ( 4 ) ： 1 7 1 8 3 周建鸿肉碱与婴儿配方食品 J 国外医学卫生学分册， 1 9 9 4， 2 1 ( 4 ) ： 2 9 0 2 9 3 4 郑九芳人体必需营养素 - L 一肉碱 J 中国食品添加剂， 1 9 9 5 ， ( 1 ) ： 5 9 6 2 5 王明鹏饲料中添加肉毒碱可节约蛋 白质 的探 讨 J 中国 饲料 ， 1 9 9 6 ， ( 7 ) ： 2 1 2 3 6 张海燕 左旋肉碱的研究及应用 J 中国食品添加剂 ， 1 9 9 7 ，( 2 ) ： 4 7 7 杨秀芳酶联荧光法测定血浆中游离肉毒碱 J 上海医科 大学学报， 1 9 9 3 ， 2 0 ( 6 ) ： 4 3 5 4 3 8 8 肖萍L 一肉碱的营养保健作用叨 食品工业， 1 9 9 7 ， c 3 ) ： 2 3 9 李全左旋肉碱盐酸盐新的合成方法 J 中国药物化学杂 志 ， 1 9 9 5， 5 ( 4 ) ： 2 7 6 2 7 7 1 0 C h a r l e s S J e t a 1 P C TI NTA P P L， 1 9 8 5 ； WO 8 5 0 4： 9 0 0 1 1 Gi a n n e s s i e t a 1 CA NP AT A P P L 1 9 9 4 ； C A2 1 1 8 9 8 1 2 S o u p p e e t a 1 E URP AT A P P L 1 9 8 6， E P 2 4 0 4 2 3 1 3 孙志浩L 一肉碱制备和应用研究的概况 J 食品与发酵工 业 ， 1 9 9 6 ， ( 2) ： 6 4 6 8 1 4 Mc c a r t h y 1 9 9 5 ； US P AT E NT 5 4 7 3 1 0 4 1 5 Ch o o n g ESNe w Me t h o d f o r t h d P r e p ara t i o n o f ( R)一 C a r n i t i n e T e t r a h e d r o n： As y mme t r y ， 1 9 9 5 ， 6 ( 5 ) ： 1 0 6 3 1 0 6 6 1 6 L U B E R T S 生物化学M 北京： 北京大学出版社， 1 9 9 0 ： 2 9 5 1 7 刘武肉碱的生物学新功用 J 生命的化学， 1 9 9 1 ， 1 1 ( 4 ) ： 】 7 一】 8 Th e Phy s i o l o g i c a l Pr e p a r a t i o n a n