土壤微生物测定方法

土壤微生物测定土壤微生物活性表示土壤中微生物群落整体或其中一些特殊种群的状态，可以反映自然或农田生态系统的微小变化。 土壤微生物活性特征量为：微生物量，C/N，土壤呼吸强度和纤维呼吸强度，微生物区系，磷酸酶活性，酶活性等。测量指标：1、土壤微生物量(Mierobia lBiomass，MB )可以代表参与土壤能量、养分循环和有机物质转化的微生物数量，一般指土壤中体积小于5103um3的生物总量。 与土壤有机质的含量密切相关。目前，熏蒸法是测定最广泛使用的土壤微生物量的方法，将测定对象的土壤用药剂熏蒸后，土壤中的微生物被杀死，被杀死的微生物体重新被人类原土样的微生物分解(矿化)而释放出CO2，根据释放出的CO2:的量和微生物体矿化率常数Kc计算该原土样微生物中的碳碳量的大小反映了微生物量的大小。此外还有平板仪(显微镜直接计数)、成分分析法、基质诱导呼吸法、熏蒸培养法(测定油污染土壤中的微生物量碳)。 土壤水分状况的影响很大，不适用强酸性土壤和刚大量施用有机肥料的土壤等)、熏蒸提取法等，可以测定土壤微生物量。熏蒸提取容量分析法操作步骤：(1)土壤预处理和熏蒸(2)提取将熏蒸土壤无损耗地转移到聚乙烯塑料瓶200mL中，加入0.5 moll-1 k2so4200 ml (图水比1:4； w:v )、30min(300revmin-1 )振荡，用中速定量滤纸过滤成125mL塑料瓶。 熏蒸开始的同时，将相同量的土壤取入聚乙烯塑料瓶200mL，直接加入100mlL0.5molL-1 K2SO4，制成提取的另3个无土壤空白。 提取液必须立即分析。(3)测量吸收上述土壤提取液10mL，向消化道(24mm前景295mm)150ml中正确加入0.018 moll-1 k2Cr2o7- 12 moll-1 h2so 4溶液10mL，加入23玻璃珠或陶片，混合后在1751的磷酸浴中煮沸10min (消化道) 冷却后，无损耗地转移到150mL的三角烧瓶中，消化管用去离子水清洗35次，溶液体积约为80mL，加入邻菲咯啉指示剂，用0.05 molL-1硫酸亚铁标准溶液滴定，溶液颜色从橙色变为蓝色，变为红褐色，这是滴定的终点。(4)结果计算有机碳量(mgCkg-1 )式中m为FeSO4溶液浓度的V0、v分别为空白和样品消耗的FeSO4溶液的体积(mL )，f为稀释倍数的w为干燥土的质量(g )土壤微生物质碳： Bc=Ec/kEC式中的Ec是熏蒸与未熏蒸土壤之差的kEC是变换系数，取值0.382 .菌种测定土壤微生物种类丰富，主要有细菌、真菌及放线菌等。 各种菌在细胞代谢中起着特殊的重要作用。细菌采用牛肉汁蛋白陈琼脂培养基平板混菌法培养测定的真菌采用马丁琼脂培养基平板混菌法培养测定的放线菌采用高氏1号琼脂培养基平板混菌法或培养基稀释平板法培养测定的淀粉。3 .土壤呼吸强度和纤维分解强度土壤呼吸强度和纤维降解强度是土壤微生物活性的重要标志，反映了土壤中微生物活性和有机质残体的降解速度和强度。 纤维素的分解强度采用埋片法呼吸强度采用碱吸收滴定法。 土壤微生物活性为土壤呼吸CO2测定法(将生土5g放入310mL试剂瓶中，在2224h时间内测定CO2释放量(用exH23os红外CO:分析计测定)。 直接测量土壤呼吸的方法基本可分为静态气室法、动态气室法和微气象法三种。密闭静置培养法原理：CO2 KOH K2CO3 H2OK2CO3 KOH KHCO3 KCl H2OKHCO3 HCl KCl H2CO3操作步骤：取20g新鲜土(为增强呼吸作用，可向土壤中加入葡萄糖，6 mgg-1 ) 500 ml宽口瓶，用水将土壤润湿至最大保水量的70%，向50mL烧杯中注入0.1 m KOH溶液50mL，密闭宽口瓶，在28恒温培养24小时。 接着取出，以苯酚酞作为指示剂，用0.1M的HCl溶液滴定。 接受相同容积的广口瓶，同样处理，不加土壤作为对照。 根据两者的差，求出为了吸收CO2而消耗的KOH量。4 .酶活性测定土壤酶多来自土壤微生物，土壤中已发现5060种酶，它们参与了土壤中一系列复杂的生物化学反应并催化。 例如水解酶和转化酶在土壤有机质的形成和养分循环中具有重要作用。 土壤酶活性与土壤结构参数有良好的相关性已被研究。 土壤微生物酶主要有脱氢酶、磷酸酶、精氨酸酶和芳基硫酸酯酶等。4.1脱氢酶活性的测定通过测定呼吸链脱氢酶活性可以表现微生物代谢活力的大小。 郑志永等人通过研究氯化碘硝基四氮瓦(INT )比色法的反应条件，确定了呼吸链脱氢酶活性的测定方法。4.2过氧化氢酶活性的测定(总部制作，需要冰箱)土壤过氧化氢酶采用高锰酸钾容量法，20min后1g土壤消耗了KMnO4(0.11lmolL-1 )的量采用测量注入土壤的过氧化氢反应后的残留量的方法进行了测量。操作步骤：取新鲜土壤样品5g至100mL三角瓶。 加入甲苯0.5mL，摇晃，在04的冰箱里放置30分钟。 取出，立即加入冰箱中储藏的含3%H2O2的水溶液25mL。 充分摇晃后，放入冰箱30分钟。 取出，迅速加入2NH2SO44mL，用0.1NKMnO4溶液滴定。 从对照和试料消耗过锰酸钾的差求出相当于分解的H2O2的量，酶活性按1g土壤、1h内消耗KMnO4的量计算。4.3尿酶活性的测定尿酶采用钠比色法，一般为1g土，以37培养24小时后释放的氨氮含量(mg )表示操作步骤：(1)标准曲线的制作：分别将0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5ml50ug/ml的氮标准溶液放入25mL的容量瓶中。 用水稀释至10mL，摇匀，加入酒石酸钾钠1mL、钠剂0.8mL，摇匀。 慢慢加入4 ml1m NaOH溶液，稀释至刻度，显色10min后，测定吸光度值。(2)称量土壤5g，放入100mL三角烧瓶。 加入ph6.7磷酸缓冲溶液10ml和甲苯0.5mL，进行15min混合处理后，加入10 ml 10 %尿素溶液(对照用水代替)，放入37的恒温槽中培养48h。(3)培养结束后取出，加入1mkcl溶液20ml，充分摇晃10min。 用滤纸过滤悬浊液，吸入1mL稀释的滤液，画标准曲线的操作中加入酒石酸钾钠、钠剂等使之显色，从标准曲线中检测出氨性氮含量。 计算土壤尿酶的活性。4.4蛋白酶活性的测定蛋白酶活性用明胶在磷酸盐缓冲液(pH=7.4)中水解生成甘氨酸的方法测定铜盐比色法方法原理：本法以精白剂为基质，使酶解后释放的氨基酸与铜盐反应形成蓝色复合体。 用比色法测定色深。操作步骤：(1)标准曲线的制作取50ug/ml甘氨酸标准溶液020mL，在蒸馏水中加入20mL，加入新制备的铜-磷酸盐溶液20mL，显色后在650nm处测定吸光度。(2)测量操作据说将5g土壤放入100mL的三角瓶中。 加入甲苯2mL，放置15min。 计