酵母双杂交操作步骤(中文翻译)

（酵母菌储存在-70中，引物和质粒DNA储存在-20中）概念：1. 次序转化:指的是先将一种质粒转化进酵母中（常是DNA-BD/bait plasmid），在选择培养基中选择出阳性克隆，之后再将另外一个质粒（AD fusion library）转化进去。优点：就是比共转化使用更少的质粒DNA，也就是节约质粒DNA。2. 共同转化：将两种质粒一起转化进酵母中。优点：比次序转化更容易操作。pGBKT7-的选择物是：kanamycin（卡那霉素）？pGADT7-的选择物是：ampicillin (氨苄西林) ？各种SD培养基：1) SD/-ade（腺嘌呤）/-leu（亮氨酸）/-trp（色氨酸）/-his （组氨酸）(1000 ml) （？“四缺”）酵母氮源（YNB）：6.7g ; -ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.60g （购买来就配好的） ; 葡萄糖 20g (即2%)2) SD/-leu/-trp/-his (1000 ml)酵母氮源（YNB）：6.7g ; -leu/-trp/-his DO supplement 0.62g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g. (即2%)3) SD/-leu/-trp (1000 ml) （？“二缺”）酵母氮源（YNB）：6.7g ; -ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.64g （购买来就配好的）; 葡萄糖 20g (即2%)4) SD/-leu (1000 ml)酵母氮源（YNB）：6.7g ; -leu DO supplement 0.69g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g (即2%)5) SD/-trp (1000 ml)酵母氮源（YNB）：6.7g ; -ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.74g ; （购买来就配好的） 葡萄糖 20g (即2%)注意：YNB有两种，一种含有硫酸胺，另外一种不含硫酸胺。我们这用的是含硫酸铵的。（买来就加进去了的）。如果不含硫酸铵，那么要在终浓度0.17%的YNB中再加入0.5%的硫酸铵，即最终在1000 ml溶液中加入总量为6.7g的YNB与硫酸铵。实际配制的方法是：1. 配制40%的葡萄糖贮存液（贮存在4），过滤除菌，待高压灭菌的溶液温度降至55以下时，再将50ml葡萄糖贮存液加入。（过滤即可使用）2. 酵母氮源6.7g，加DO supplement 在920ml水中溶解，调PH至5.8（大约加10M NaOH 200ul即可），之后补水至950 ml。3. 高压完后待温度降至55以下，加入50 ml40%葡萄糖。YPD培养基(1000 ml)20 g/L 蛋白胨10 g/L 酵母提取物20 g/L 琼脂（只有制作平板才用）20 g/L 葡萄糖 (即2%)1x YPDA培养基(1000 ml) 20 g/L 蛋白胨10 g/L 酵母提取物0.03 g/L 腺嘌呤 （即终浓度为0.003）腺嘌呤可以耐受高温20 g/L 葡萄糖 (即2%)实际配制的方法是：1. 配制40%的葡萄糖贮存液（贮存在4），过滤除菌，待高压灭菌的溶液温度降至55以下时，再将50ml葡萄糖贮存液加入。（李博士经验这一步不高压，过滤即可使用）2. 配制0.2%的腺嘌呤溶液，过滤除菌，待高压灭菌的溶液温度降至55以下时，再将15ml腺嘌呤溶液加入。（或将腺嘌呤直接加进去，为了方便我将直接加进去一起高压）3. （蛋白胨 20g ；酵母提取物10g ；水大约925ml）混合后，调至PH至6.5，加水至935ml，121高压15min。注意：u 高压的温度和时间不能太长与太高，121高压15min即可。u 可以在YPDA中加入20 g/L的琼脂，以配成平板。u 需要加kanamycin时，kan终浓度是1015 mg/L。（kanamycin可以20贮存一个月，加入到平板中去可以4贮存一个月。）PEG/LiAc溶液（即配即用）用下列贮存液来配制50% PEG 3350：用灭菌水配，如需要可以加热至50以助溶。10X TE buffer：用灭菌水配，如需要可以加热至50以助溶。10X LiAc：用灭菌水配，如需要可以加热至50以助溶。最后配成PEG/LiAc溶液是：（以10ml为例） 终浓度 为配制10mlPEG/LiAc需要加入的物质PEG 4000 40% 8 ml of 50% PEGTE buffer 1X 1 ml of 10X TELiAc 1X 1 ml of 10X LiAc无菌1x TE/LiAc溶液（用10x已灭菌的贮存液稀释）10x TE buffer : 0.1 M Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 7.5(高压)10x LiAc ： 1 M 用稀醋酸调节PH至7.5 高压For -galactosidase 滤膜实验Z buffer溶液：Na2HPO4 7H2O 16.1 g/L （如换Na2HPO4 14H2O 则 20.739 g/L）NaH2PO4 H2O 5.50 g/L （如换NaH2PO4 2H2O 则 6. 21g/L）KCl 0.75 g/LMgSO4 7H2O 0.246 g/L最后调PH至7.0，高压，室温下可以贮存1年X-gal 溶液：X-GAL溶解于DMF（二甲基甲酰胺）中至浓度为20 mg/ml.，20C避光保存Z buffer/X-gal 溶液：100 ml Z buffer0.27 ml -mercaptoethanol （-巯基乙醇）1.67 ml X-gal 贮存液ONPG 溶液：（即配即用）ONPG溶于Z buffer中，终浓度4 mg/ml，调PH至7.0.注意：1. ONPG需要12h才能溶解2. 每次用之前新鲜制备。带有-巯基乙醇的Z buffer将0.27 ml-巯基乙醇加入100 ml Z buffer中即可为了转化成功的小提示： 1.用一个13周龄（直径23mm）的菌落去接种液体培养基。如果菌落直径2mm，就用多几个菌落去接种。（也要大力涡旋使细胞团分散开来。） 2.如果过夜或者3hr之后的培养基明显成块，那么在使用之前一定要充分涡旋使培养基。 3.当通过离心收集细胞的时候，使用一个离心管即可，可以更好、更充分地收集细胞。 4.为了提高转化效率，要在1小时内准备酵母感受态细胞。如果有必要，可以在11步之后在室温条件下储存酵母感受态细胞几个小时，而活性却只有一点降低。 5.当进行通同转化的时候，诱饵（BD）质粒的量必须过度，而AD质粒的量要不足。一般BD是AD的两倍。（李博士：此要求一般是针对文库筛选而言）6.为了使菌落更好地生长，在涂布转化复合物到琼脂平板上时要直到所有液体被吸收。可以选择直径5mm的无菌玻璃珠（每一个100mm的平板用5-7个玻璃珠，直径150mm的平板用7-9个玻璃珠）去促进转化复合物的扩散，摇动的时候shake the plate back and forthnot round and round. （科内似并无此操作，而仅仅以玻棒涂布耳）一. 复苏酵母：将酵母细胞接种到YPD固体培养基中培养，培养1-3周。（接种的时候采取四区分区画线法）二. 酵母感受态细胞置备和转化步骤：1.取直径23mm的克隆接种到1ml的YPD或SD培养基中。2.剧烈振荡或涡旋5min，使所有团块分散开来。3.转移酵母液到50 mlYPD（？固体也有液态的，未加入琼脂粉耳）或者SD培养基中。4.置于30摇床中，以250 rpm的转速震荡培养基1618h，直到OD6001.55.转移部分过夜培养物（30ml）到300mlYPD培养基（？固体）中，使最终OD600 在0.20.3之间。6.30摇床以230 rpm的转速震荡培养基34h直至OD为 0.40.6.（If the OD600 is 0.4, something is wrong with the culture）7.转移酵母液至50ml离心管中，1000g室温（2021C）离心5min8.弃去上清，加入2550ml无菌水或无菌的1x TE重悬酵母。9.在1000g室温（2021C）条件下离心5min10.轻轻倒出（弃去）上清11.将细胞重悬于1.5ml新鲜准备的，无菌的1xTE/1xLiAc（在实验开始之前置备）(至此酵母感受态细胞制备完毕)12. 向无菌的1.5ml微量离心管中加入质粒DNA各0.1ug和0.1mg鲱鱼精载体DNA，之后轻轻混匀。13.再向每管中加入0.1 ml 酵母感受态细胞，并且震荡混匀。14.向每一管加入600 ul无菌PEG/LiAc溶液，高速振荡混匀。15.30摇床以200 rpm的转速振荡培养30 min16.向每一管加入70 ul DMSO 轻轻颠倒混匀，不要震荡。17.42水浴热激15 min18.取出后在冰上冷却1-2 min19.1000 rpm室温离心5 min，弃去上清。20.用0.5 ml 无菌的1TE重悬酵母。21.取合适体积的菌液（一般是100 ul）涂在选择性的SD培养基的平板上，在30培养箱中培养2-4天。（将克隆分成三份涂与不同平板上，1/3涂在SD/His/Leu/Trp，1/3涂在SD/Ade/His/Leu/Trp，最后1/3涂在SD/Leu/Trp上。） （科内仅涂布二缺与四缺板）（在21步之后涂一个二缺板和一个四缺板）因为在二缺板中AH109能生长，说明BD和AD已经转进去了。如果在四缺板中能生长，说明诱饵和文库肯定有作用，接着做一个- gal实验。如果是将质粒转到Y187中的话，21步之后涂一个二缺板就行了。如果酵母能生长的话就接着做一个- gal。所以有的人同时转化两种菌种。这样就完全可以确定两蛋白是否有作用了。之后计算转化率，如果转化率达到10的6次方以上，那么就可以接着做后面的检验实验。三. 和-gal实验：（我就做-gal试验，要注意如果做-gal的话，这时候菌种要换成Y187，而不是之前的AH109）（在protocol 的2428页）1.试剂：2.原理：u ONPG为无色物质，在-半乳糖苷酶的作用催化下生成黄色的onitrophenol(硝基苯酚)，在420 nm (OD410)处有光吸收。u Na2CO3可以提高PH值，使酶变性，从而终止反应。（Na2CO3在配制时，不需要高压）3.实验方法一. Colony-lift Filter Assay（滤膜分析或滤膜试验）（这是定性试验）a) 将要测试的菌株（直径1-3mm）转接到新的选择性SD培养基中，30培养2-4天。b) 准备Z buffer/X-gal 溶液。c) 为每一个要测试的平板准备好一张无菌的Whatman 滤纸，置于100mm或150mm无菌平板中用2.5-5ml Z buffer/X-gal 溶液浸泡。d) 用无菌的镊子小心地将无菌Whatman 滤纸覆盖到平板表面，要使所有的待测菌株都有部分沾到滤纸上。e) 用注射器在滤纸上打3个或更多的不对称的孔，以标志方向。f) 滤纸放入液氮中0.51min至结冰，之后再放置于室温融化，如此反复冻融3次。g) 小心地将带有菌株的滤纸放到预浸泡的滤纸上，有菌株一面向上，注意两层滤纸中间不要有气泡。h) 平板放到30培养箱中，观察其是否变蓝。一般阳性克隆在0.58h内会变蓝，超过8h容易产生假阳性结果。二 . Liquid Culture Assay（以ONPG为底物的液体培养法）（这是定量试验）1) 在合适的SD培养基中制备5 ml过度培养物。注意：你所选用的SD培养基要适合你所用的系统和质粒。2) 在进行实验当天，将ONPG以4 mg/ml 的浓度溶于Z buffer中，振荡12h确保完全溶解。3) 大力涡旋过夜培养基1min以分散细胞团块，立即转移2ml（0.5ml）过夜培养基物到8ml (2ml)YPD培溶液中。（以25%的含量加）4) 30培养35h（230-250 rpm）直至细胞进入对数生长期（1ml溶液的OD600应在0.5-0.8之间）在收获细胞的同时记录OD600值。注意：在检测OD值的时候，涡旋培养基0.5-1ml以分散细胞团块5) 各吸取1.5 ml（0.5 ml）培养物到各3个1.5 ml离心管（每个管子就是1.5ml），离心14000 rpm/30sec。6) 小心移去上清，加上1.5 ml（0.5 ml）Z buffer到每个管中，涡旋直到细胞重悬。7) 再次离心并移去上清，加上300ul（100 ul）Z buffer到每个管中，涡旋直到细胞重悬。这样，终浓度就是1.5/0.3 = 5倍。注意：在这个清洗步骤之后，细胞收获物的差异可以通过再次读取OD600值来纠正。8) 转移0.1ml细胞悬液至新的离心管中。9) 将细胞置于液氮中（约0.51min）直至细胞冰冻。10) 将离心管放于37水浴中0.51min使其融化。11) 反复冻融3次（重复9和10步）确保细胞裂解。12) 用100 ul Z buffer.来设置一个空白对照。13) 加0.7 ml 的Z buffer 与-巯基乙醇到反应管和空白管中注意：在冰冻之前