生物酶工程—融合酶

Bioenzymeengineering,融合酶,2011级生物工程69班,目录Contents,研究意义,学习目标,1.掌握融合酶的定义；2.理解并掌握融合酶的构建策略；3.了解融合酶在生产生活中的应用及其发展前景。,融合酶的定义,由二种或以上酶成分构成,将来自不同酶的结构单元(功能基、二级结构、三级结构、或功能域)或是整个酶分子进行组合或交换，产生具有所需要性质的优化酶杂合体，即为融合酶。,融合酶的研究意义,1.现有酶在相应的工业条件下，稳定性差或催化水平低；2.工程菌生产的酶变性后形成包涵体，复性效率不高,且对蛋白水解酶敏感；3.底物专一性或催化功能需要改变；,融合酶的研究意义,4.需要具有催化新反应的酶（自然界不存在的）。5.杂合酶技术在改变酶的酶学或非酶学特性。弄清结构与功能的关系上也起重要作用,融合酶出现是酶学发展的必然结果，蛋白质工程在杂合酶的构建中发挥关键作用。其构建利用了自然界进化的各种各样的性质以及自然界用于进化酶的各种策略。,非合理突变法：通过随机突变，DNA改组，易错PCR等方法以实现大规模突变现有酶个体，并从中筛选出符合要求的进化酶的方法。但这种方法盲目且耗时，即使出现噬菌体呈现技术这样的高通量筛选技术，也只能局限于短的片段,酶分子的构建途径,合理设计法：通过生物化学，晶体学，光谱学等方法对天然酶或其突变体进行研究，获得酶的结构和功能之间的关系，并通过将功能部位转移至适当蛋白质骨架上，以改变酶的催化及非催化特性的方法称为合理设计法,酶分子的构建途径,融合酶的构建策略,一、二级结构融合杂合酶中的二级结构互换可以产生酶的新的催化特性或其他新的物理化学特性,酶A,二级结构替换后的融合酶,替换,融合,酶B,E.coli异柠檬酸脱氢酶,异丙基苹果酸脱氢酶,E.coli异柠檬酸脱氢酶,异丙基苹果酸脱氢酶,E.coli异柠檬酸脱氢酶和异丙基苹果酸脱氢酶的对辅酶NADH和NADPH的优先性互换,-螺旋,优先结合辅酶NADH结构,优先结合辅酶NADPH结构,-转角,二、功能域融合把功能域看作是构成酶的组件，若活性部位位于不同的结构域上，可以通过功能域的交换或程序化的的组合来构建催化特定反应的酶。,插入,融合,功能域转移的三种不同方式,1.功能域转移至同系结构蛋白上,识别结构域,非特异性DNA裂解结构域,DNA限制性内切酶2,果蝇的DNA结合模块模块及锌指蛋白,非特异性DNA裂解结构与,果蝇的DNA结合模块模块及锌指蛋白,具有新的裂解识别位点的酶,替换,融合,锌指蛋白作为DNA的结合元件，通过锌指结构的重新设计，使其识别任何三联密码子，进而通过一系列锌指结构的连接，构建对任意DNA序列特异性的限制酶,2.功能域转移至宿主骨架蛋白上,RGD：Arg-Gly-Asp组成的三肽，为人纤维连接蛋白与其受体的结合位点，存在于许多细胞的粘附蛋白中，可被细胞表面的受体整合素所识别。,2.功能域转移至宿主骨架蛋白上,黏附蛋白,RGD三肽,溶菌酶,RGD三肽,溶菌酶杂合体,新的溶菌酶杂合体具有黏附蛋白5%-10%粘附活力,细胞,3.功能域转移至结构不同的适当天然骨架上，仍保留结构部位的结构和功能。,替换,融合,谷胱甘肽转硫酶（GST）具有谷胱甘肽结合部位，其Ser可与谷胱甘肽的巯基结合形成氢键来稳定谷胱甘肽的巯基形式，通过把谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）的硒代半胱氨酸转移酶催化集团转移到GST的Ser上，成功的将GST转化为GPX。,Ser,CH2,OH,Ser,CH2,O,S,CH2PH,Ser,CH2,SeH,O,O,化学突变法制备含硒酶的原理图,在天然蛋白质骨架上引入活性部位，产生功能蛋白质,优点：1.有助于理解底物-酶、辅酶-酶、DNA-蛋白质、配体-受体、蛋白质-蛋白质之间相互作用专一性的结构决定因素。2.可产生新的专一性，作为药物设计和发现的模板。3.有望用新的结构骨架，诱导特定序列的特定构象或稳定预定活性部位的结构。,在天然蛋白质骨架上引入活性部位，产生功能蛋白质,4.有可能构建特定的结构域，代表一套二级结构模块，将活性序列转移到模块上，产生新功能酶。5.转移序列可在噬菌体表面稳定表达，可通过筛选、分析而进行更换，以增加其生物活力，获得具有特定功能的人工蛋白质。,三、整个酶蛋白的融合转移整个蛋白质，得到融合蛋白，既可以是双功能的，也可以是多功能的融合蛋白。,酶1,酶2,将两个蛋白的基因组合到一起，可能得到具有双功能的融合蛋白。通过一个连接肽编码序列将糖化酶（GA）基因的5端融合到葡萄糖氧化酶（GOD）基因的3端，构建了一个融合基因。将融合基因克隆表达后，得到一个分子量为430ku的大杂合酶（GLG）。,融合酶的应用,一、理论研究方面1.确定蛋白质结构与功能的对应关系杂合酶常常被用来确定相关酶之间的差异，表征给予酶特殊性质的那些残基或结构，一种酶具有这种特殊性质，而另一种同系酶则不具备。用于表征与底物结合部位有关的其他独特的结构域。用于研究相关酶结构域顺序对比的相对价值。,2.确定蛋白质之间的相互作用很多融合酶是由结构域侧面连接而成，这些机构域的折叠是独立的，各自在空间上有很大的自由度，为了达到酶活力的最大化，可在结构域间创建别构作用。融合酶的别构效应可以有助于了解蛋白质之间的相互作用。,1.非催化特性的优化通过融合酶的构建，通过相关酶同源区域的残基和结构的交换可改变酶的热稳定性，最适PH值，最适温度，酸碱稳定性等非催化特异性等条件2.创造新催化活性酶通过融合酶的构建可以改变酶的底物结合，辅酶结合，酶活力，催化特异性,二、实际应用方面,3、研究酶及其它蛋白质的定位及移动,标签结构域可以使蛋白质分布到机体的特定部位，通过对标签结构与的跟踪识别，是研究酶定位与移动的特定手段。,4、在酶内部创建别构作用,酶的各个结构域部件多数是独立的，并拥有充分的空间自由度，但其活性部位的松散，是酶不能达到最佳性能，通过将一个或多个结构域插入到另一结构与的合适部位，以此在酶的内部各个结构域间构建别构作用，来达到优化酶催化特性的目的。,5、构建具有双催化作用的功能酶,把酶蛋白基因的末端