微生物工程-第五章-发酵工业种子制备

第五章,发酵工业的种子制备,本章内容：,种子制备原理与技术影响种子质量的因素种子质量的控制措施种子制备的放大原理与技术,种子扩大培养,培养基配制,空气除菌,培养基灭菌,发酵生产,下游处理,发酵设备,发酵工程的工艺流程,产品,摇瓶-小试-中试,5L小试,5L-50L二级发酵装置,一、种子制备原理与技术,优良种子应具备的条件：生长活力强，延迟期短；生理状态稳定；浓度及总量能满足发酵罐接种量的要求；无杂菌污染，保证纯种发酵；适应性强，生产能力稳定,重点,种子罐级数的确定,种子扩大的级数：制备种子需逐级扩大培养的次数级数愈少，愈利于简化工艺及控制，并可减少种子罐污染杂菌的机会，减少消毒及值班工作量，减少因种子罐生长异常而造成的发酵波动。,种子罐级数确定方法：,菌种的性质(如菌种传代后的稳定性);瓶中的孢子数，孢子发芽及菌丝繁殖速度;发酵罐中种子培养液的最低接种量;种子罐与发酵罐的容积比;生产规模;随工艺条件的改变作适当的调整。,通常检测的培养液中参数pH是否在种子要求的范围之内糖、氨基氮、磷酸盐的含量菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观有无杂菌污染其他参数如接种前酶活、种子罐的溶氧和尾气等,种子质量的判断方法：,放罐，后处理,产品,斜面培养基中活化；扁瓶固体培养基或摇瓶培养基中扩大培养，完成实验室种子制备；一级种子罐，制备生产用种子；视情况确定扩大级数，完成生产车间种子制备；种子转种至发酵罐,种子制备步骤：,重点,工业发酵种子制备过程：,实验室种子制备阶段：琼脂斜面至固体培养基扩大培养（如茄子瓶斜面培养等）或液体摇瓶培养；生产车间种子制备阶段：种子罐扩大培养,实验室种子制备,无菌方式接保藏的菌种至斜面培养基上，成熟后挑选正常菌落至试管斜面和摇瓶；菌种产孢子能力强及孢子发芽、生长繁殖迅速，可用固体培养基培养孢子；菌种产孢子能力不强或孢子发芽慢，可用摇瓶液体培养法；不产孢子的菌种，保藏基础上，在一定温度下活化即可。,种子扩大培养阶段液体培养法：液体试管、三角瓶摇床振荡或回旋式培养。表面培养法：茄子瓶、克氏瓶或瓷盘培养。固体培养法：三角瓶、蘑菇瓶、克氏瓶、培养皿等麸皮培养。,生产车间种子制备,实验室制备的孢子斜面或摇瓶种子移接到种子罐进行扩大培养。种子罐培养目的:1、获得足够的菌种数量，2、种子罐的培养基接近发酵罐培养的醪液成分和培养条件，使菌体适应发酵环境。,种子罐级数越少，越有利于简化工艺和控制，并减少由于多次转种而带来的染菌机会以及减少因种子罐生长异常而造成的发酵波动；种子罐级数设计需考虑能否在一定时间内获得优质、足量的种子以满足发酵的需求。,15L种子发酵罐,种龄与接种量,接种龄概念：种子罐中培养的菌体从开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。种子培养期应取菌种的对数生长期为宜，菌种过嫩或过老，不但延长发酵周期，而且会降低产量。,放射形土壤杆菌多糖（ARPS）发酵过程中不同的接种龄对多糖产量的影响,接种量过多，菌丝生长过快、溶氧不足，衰老细胞增加等，发酵后劲不足接种量过少延长发酵周期，形成异常形态，而且易造成染菌。以生产菌种在发酵罐中的繁殖速度为依据接种量的大小直接影响发酵周期。,大量地接入培养成熟的菌种的优点：缩短生长过程的延缓期，因而缩短了发酵周期，提高了设备利用率；节约发酵培养的动力消耗；有利于减少染菌机会。,接种量：概念：移入的种子液体积和接种后培养液体的体积的比例。,在放射形土壤杆菌多糖（ARPS）发酵过程中不同的接种量对多糖产量的影响,影响种子质量的因素,原材料质量培养温度湿度通气与搅拌,斜面冷藏时间培养基pH,原材料质量,原材料质量波动引起种子质量不稳定。原材料质量波动的主要原因：无机离子含量不同（微量元素Mg2+、Cu2+、Ba2+能刺激孢子的形成，磷含量太多或太少也会影响孢子的质量）。,例1：四环素、土霉素生产中，配制产孢子斜面培养基用的麸皮，因小麦产地、品种、加工方法及用量的不同对孢子质量的影响也不同。例2：制备霉菌用的大(小)米，其产地、颗粒大小、均匀程度不同，孢子质量也不同。例3：蛋白胨加工原料不同，对孢子影响也不同。例4：琼脂的牌号不同，其中含无机离子的差别而引起孢子质量的变化。例5：水质的硬度、污染程度对生产均有影响。,培养温度,温度过低，菌种生长发育缓慢温度过高，会使菌丝过早自溶,湿度低，孢子生长快；湿度大，孢子生长慢。,不同相对湿度对龟裂链霉菌斜面生长的影响,湿度,溶解氧的作用：参与菌体呼吸作用;搅拌：促进氧的溶解与营养物质及代谢产物的扩散。通气量的多少以溶解氧的多少来衡定。通气过程中，影响溶解氧的因素：菌种；培养基性质；培养阶段；发酵罐的结构；,通气与搅拌,足够的通气量，以保证菌种代谢正常，提高种子的质量。搅拌可提高通气效果，促进生长繁殖，过度搅拌导致培养液大量涌泡，液膜表面的酶易氧化变性，泡沫过多增加染菌机会，增加能耗；丝状微生物不宜剧烈搅拌。,斜面冷藏时间,对孢子的生产能力有较大影响冷藏时间越长，生产能力下降越多,培养基,培养种子的目的：扩大培养，增加细胞数量；同时也必须培养出强壮、健康、活性高的细胞。为了使细胞迅速进行分裂或菌丝快速生长。,有较完全和丰富的营养物质，糖分少，需充足氮源和生长因子，无机氮源比例大；各种营养物质的浓度不必太高；供孢子用的种子培养基，可添加易被吸收利用的碳源和氮源；应考虑与发酵培养基的主要成分相近。,种子培养基特点：,pH,选择最适种子培养pH的原则是获得最大比生长速率和适当的菌量。培养最后一级种子的培养基的pH应接近于发酵培养基的pH，以便种子能尽快适应新的环境。,种子质量的控制措施,菌种稳定性检查适宜的生长环境种子无杂菌检查,种子制备的放大原理与技术,细菌发酵时的种子扩大培养：细菌发酵过程中种子扩大培养的主要目的是为了获得大量的活力强的种子；种龄对于生芽孢的种子尤其重要。若接种物含大量芽孢，将给后续发酵带来较长迟滞期,为什么细菌发酵最好是在对数生长期接种？,种子浓度够代谢活力强,重点,梭状芽孢杆菌发酵丁醇丙酮时种子扩大培养的程序,举例：,酿酒酵母的扩大培养最初采用纯种进行酵母发酵并设计出酵母繁殖流程，他将每一步的接种量规定为10，并控制繁殖条件与酿造时一致现代的流程中，接种量为1%或更低，控制的条件也与酿造时不同。,酵母发酵时的种子扩大培养,面包酵母的扩大培养初始种子培养也要求采用纯种培养大容积发酵培养时，没有无菌要求,面包酵母时的种子扩大培养的程序,丝状真菌发酵的种子扩大培养,丝状真菌既可以利用孢子，也可以利用菌丝体作为接种物接种到发酵罐进行发酵,在固化的培养基上产生孢子“滚瓶”技术应用于产黄青霉的孢子生产在固体培养基上产生孢子在谷类的颗粒表面形成大量的孢子在液体深层培养基中产生孢子,利用孢子作为接种物,菌丝体作为接种物,不能产生无性孢子的用繁殖体菌丝作为接种物，如生产赤霉素的菌种藤仓赤霉问题：难以获得均一的接种物接种前将菌丝打成碎片，形成大量的菌丝段，它具有大量的生长点,放线菌发酵时的种子扩大培养,斜面培养，制备孢子悬浮液作初级种子也可用培养摇瓶菌丝体作为初级种子,制备过程,斜面菌种,一级种子培养,二级种子培养,发酵,谷氨酸生产种子制备,1、斜面(AS1.299),培养基：蛋白胨1%，牛肉膏1%，氯化钠0.5琼脂2%，pH7.0-7.2,培养基特点：有利于菌体的生长，原料比较精细,培养条件：32，生长18-24小时,生长斜面要求：生长良好，所使用斜面连续传代不超过3次,2、一级种子（摇瓶）,培养条件：于1000ml三角瓶中，装液200-250mL,32培养12小时。,培养基：葡萄糖2%，尿素0.5%，玉米浆2.5%，K2HPO40.1%,培养基特点：有利于菌体的生长，所使用的原料已经基本接近于发酵培养基,3、二级种子(种子罐),培养条件：在种子罐中培养（容积为发酵罐的1%）,32培养7-10个小时,培养基：和一级种子相似，其中葡萄糖用水解糖代替，浓度为2.5%,培养基的特点：长菌体，更接近于发酵培养基,种子的质量要求：,108-109个/mL大小均匀，呈单个或八字排列pH7.0-7.2时结束，6.887.0-7.2活力旺盛,安瓿管,斜面孢子,大米孢子,一级种子,二级种子,发酵,青霉素生产种子制备,制备过程,1、斜面孢子,培养基：甘油、葡萄糖、蛋白胨等,培养基特点：有利于长孢子，用量少而精细,培养条件：25、7天,注意湿度50%左右,2、大米孢子,培养基：大米及氮源（玉米浆）,培养基的特点：成本低、米粒之间结构疏松提高比表面积和氧的传质，营养适当（要求大米的白点小）有利于孢子的生长。,培养条件：25、7天，控制湿度,大米孢子的要求：1粒米含1.4*106个孢子,3、一级种子,培养基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米浆,目的：长菌体,培养条件：27，40小时,接种量：200亿孢子/吨,4、二级种子,培养基：同一级种子,培养条件：27、10-14小时,接种量：10%,种子的质量要求：,菌丝长稠呈丝状、菌丝团很少，有中