食品检验基础知识

食品检验基础知识,苏州市产品质量监督检验所,讲课提纲,第一讲：食品检验用水第二讲：食品检验用试剂第三讲：食品检验用器皿及要求第四讲：食品检验的一般步骤第五讲：食品检验的有关要求第六讲：食品检验溶液的配制第七讲：食品检验结果的处理第八讲：食品微生物学检测基础,第一讲食品检验用水,一、检验用水的要求化学检验应使用纯水，一般是蒸馏水或去离子水。有的实验要求用二次蒸馏水或更高规格的纯水。纯水并非绝对不含杂质，只是杂质含量极其微量而已。分析化学实验用水的级别及主要技术指标，见表1。,表1实验室用水的级别及主要技术指标（载自GB668292）,(一)蒸馏水,通过蒸馏方法、除去水中非挥发性杂质而得到的纯水称为蒸馏水。同是蒸馏所得纯水，其中含有的杂质种类和含量也不同。用玻璃蒸馏器蒸馏所得的水含有Na+和SiO2等；而用铜蒸馏器所制得的纯水则可能含有Cu2+离子。,(二)去离子水,利用离子交换剂去除水中的阳离子和阴离子杂质所得的纯水，称之为离子交换水或“去离子水”。未进行处理的去离子水可能含有微生物和有机物杂质，使用时应注意。,既可用去离子水，也可采用蒸馏水。实验用纯水必须注意保持纯净、避免污染。通常采用以聚乙烯为材料制成的容器盛载实验用纯水。,(三)食品检验用水要求,每一批纯水，都必须进行质量检验。一般应达到以下标准：（1）用电导仪测定的电导率小于或等于530S/cm(25)。（2）酸度呈中性或弱酸性，pH=5.07.5(25)。（3）无有机物和微生物污染。（4）钙、镁等金属离子含量合格。（5）氯离子含量合格。,(四)食品分析用水的检验,化学试剂是符合一定质量标准的纯度较高的化学物质，它是分析工作的物质基础。能否正确选择、使用化学试剂，将直接影响到分析实验的成败、准确度的高低。食品检验人员必须充分了解化学试剂的性质、类别、用途与使用方面的知识。,第二讲食品检验用试剂,根据质量标准及用途的不同，化学试剂可大体分为:标准试剂普通试剂高纯试剂专用试剂,（一）化学试剂的分类,（1）标准试剂标准试剂是用于衡量其它（欲测）物质化学量的标准物质，习惯称之为基准试剂，其特点是主体含量高，使用可靠。我国规定滴定分析第一基准和滴定分析工作基准的其主体含量分别为1000.02%和1000.05%。,表2食品检验中主要标准试剂及用途,（2）一般试剂/普通试剂,一般试剂是实验室最普遍使用的试剂，其规格是以其中所含杂质的多少来划分，包括通用的一、二、三、四级试剂和生化试剂等。一般试剂的分级、标志、标签颜色和主要用途列于表3。,表3一般化学试剂的规格及选用,（3）专用试剂专用试剂顾名思义是指专门用途的试剂。例如在色谱分析法中用的色谱纯试剂、色谱分析专用载体、填料、固定液和薄层分析试剂，光学分析法中使用的光谱纯试剂和其它分析法中的专用试剂。专用试剂除了符合高纯试剂的要求外，更重要的是在特定的用途中、其干扰的杂质成分不产生明显干扰的限度之下。,(4)高纯试剂高纯试剂主体成分含量通常与优级纯试剂相当，但杂质含量很低，而且杂质检测项目比优级纯或基准试剂多12倍。高纯试剂主要用于微量分析中试样的分解及试液的制备。,各种试剂要根据检验项目的要求和检验方法的规定，合理、正确地选择使用。例如，配制铬酸洗液时，仅需工业用的K2Cr2O7和工业硫酸即可。食品检验常用分析纯试剂(AR)。对于滴定分析常用的标准溶液，应采用分析纯试剂配制，再用基准试剂标定.,（二）化学试剂的选用,分析纯试剂与基准试剂,分析纯试剂：红色标签,基准试剂：绿色标签,（1）打开瓶盖（塞）取出试剂后，应立即将瓶（塞）盖好，以免试剂吸潮、沾污和变质。（2）瓶盖（塞）不许随意放置，以免被其它物质沾污，影响原瓶试剂质量。（3）试剂应直接从原试剂瓶取用，多取试剂不允许倒回原试剂瓶。,（三）使用试剂注意事项,（4）固体试剂应用洁净干燥的小勺取用。取用强碱性试剂后的小勺应立即洗净，以免腐蚀。（5）用吸管取用液态试剂时，决不许用同一吸管同时吸取二种试剂。（6）盛装试剂的瓶上，应贴有标明试剂名称、规格及出厂日期的标签，没有标签或标签字迹难以辨认的试剂，在未确定其成份前，不能随便用。,有机试剂：使用三氯甲烷、四氯甲碳、乙醚、苯、丙酮、己烷等低沸点有机溶剂时，一定要远离火源和热源。装有上述试剂的试剂瓶应封严，并放在阴凉处保存。使用有毒有机溶剂时应在通风橱内操作，防止意外事故发生。无机试剂：浓酸、浓碱具有强烈的腐蚀性。使用浓硝酸、浓盐酸、浓硫酸、高氯酸及氨水时，应在通风橱中操作。如上述试剂溅到皮肤上或眼内，应立即用水冲洗，然后用5%NaHCO3或5%H3BO3冲洗。标识：自配试剂应贴标签，并注明化合物名称、浓度、配制日期，以及配制人姓名。,试剂放置不当可能引起质量和组分的变化，因此，正确保存试剂非常重要。（1）一般化学试剂应保存在通风良好、干净的房子里，避免水分，灰尘及其它物质的沾污，并根据试剂的性质采取相应的保存方法和措施。,（四）试剂的保存,续,（2）容易腐蚀玻璃影响试剂纯度的试剂，应保存在塑料或涂有石蜡的玻璃瓶中。如：氢氟酸、氟化物（氟化钠、氟化钾、氟化铵）、苛性碱（氢氧化钾、氢氧化钠）等。（3）见光易分解，遇空气易被氧化和易挥发的试剂应保存在棕色瓶里，放置在冷暗处。如过氧化氢（双氧水）、硝酸银、高锰酸钾、草酸等属见光易分解物质；氯化亚锡，硫酸亚铁，亚硫酸钠等属易被空气逐渐氧化的物质；溴、氨水及大多有机溶剂属易挥发的物质。,续,（4）吸水性强的试剂应严格密封保存。如：无水碳酸钠，苛性钠，过氧化物等。（5）易相互作用、易燃、易爆炸的试剂，应分开贮存在阴凉通风的地方。如：酸与氨水、氧化剂与还原剂属易相互作用物质；有机溶剂属易燃试剂；氯酸、过氧化氢、硝基化合物属易爆炸试剂等。（6）剧毒试剂应专门保管，严格取用手续，以免发生中毒事故。如：氰化物（氰化钾、氰化钠）、氢氟酸、二氯化汞、三氧化二砷（砒霜）等属剧毒试剂。,第三讲食品检验用器皿及要求,分析检验时离不开各种器皿，所需的器皿应根据检验方法的要求来选用。一般应选用硬质的玻璃仪器；有些试剂对玻璃有腐蚀性(如氢氧化钠等)，需选聚乙烯瓶贮存；遇光不稳定的试剂(如硝酸（银、碘等)应选择棕色玻璃瓶避光贮存。选用时还应考虑到容量及容量精度和加热的要求等。,1、器皿的选用,检验中所使用的各种器皿必须洁净，否则会造成结果误差，这是微量和痕量分析中极为重要的问题。,图1.4(a)图1.4(b)图1.4(c)图1.4(d)塑料洗瓶锥形瓶碘量瓶高形称量瓶烧杯,食品检验常用的玻璃仪器及器皿,图1.4(e)图1.4(f)图1.6(g)扁形称量瓶普通干燥器真空干燥器,图1.4(h)图1.4(i)图1.4(j)图1.4(k)图1.4(l)坩埚钳酸式滴定管碱式滴定管移液管吸量管,图1.4(m)图1.4(n)容量瓶玻璃漏斗,溶液配制,常压过滤/普通过滤,减压过滤/真空过滤/抽滤,布氏漏斗,2、洗涤液的配制,盐酸-乙醇溶液取一定体积的盐酸（36%），将其倒入等体积的乙醇(95%）中，混匀备用。用于洗涤被带色有机物污染的比色皿及玻璃仪器。,重铬酸钾-硫酸洗液铬酸洗液称取10g重铬酸钾（工业纯）于400ml烧杯中，加入少量水溶解后，慢慢地加入200ml硫酸（工业纯），边加边搅，混匀备用。用于洗涤被有机物污染的玻璃仪器。,碱性酒精洗液：用体积分数为95的乙醇与质量分数为30的氢氧化钠溶液等体积混合。肥皂水洗衣粉水去污粉水,3、器皿的洗涤方法1)新的玻璃器皿：先用自来水冲洗，晾干后用铬酸洗液浸泡，以除去粘附的其它物质，然后用自来水冲洗干净。2)有油污的玻璃器皿：先用碱性酒精洗液洗涤，然后用洗衣粉水或肥皂水洗涤，再用自来水冲洗干净。3)有凡士林油污的器皿：先将凡士林擦去，再在洗衣粉水或肥皂水中烧煮，取出后用自来水冲洗干净。4)有锈迹、水垢的器皿：用(1+3)盐酸洗液浸泡，再用自来水冲洗干净。,5)瓷坩埚污物：用(1+3)盐酸洗液洗涤，再用自来水冲洗干净。6)铂坩埚污物：用(1+3)盐酸洗液煮沸洗涤，再用自来水冲洗干净。7)比色皿：先用自来水冲洗；再用稀盐酸洗涤，然后用自来水冲洗干净。8)塑料器皿：用稀硝酸洗涤后，再用自来水冲洗干净。为了保证器皿洗涤后能达到洁净的要求，要用蒸馏水冲洗掉内壁附着的自来水，一般用蒸馏水淋洗23次。蒸馏水淋洗时应少量多次，以达到节约蒸馏水和洁净器皿的目的。,4、仪器设备要求(1)玻璃量器的要求检验方法中所使用的滴定管、移液管、容量瓶、刻度吸管、比色管等玻璃量器均须按国家有关规定及规程进行校正。玻璃量器和玻璃器皿须经彻底洗净后才能使用。(2)控温设备的要求检验方法中所使用的马弗炉、恒温干燥箱、恒温水浴锅等均须按国家有关规程进行测试和校正。(3)测量仪器的要求天平、酸度计、温度计、分光光度计、色谱仪等均应按国家有关规程进行测试和校正。,第四讲食品检验的一般步骤,食品检验的基本步骤为：样品的采集；样品的处理；样品的分析检测；分析结果的记录与处理四个阶段。,1、样品的采集,样品的采集是指抽取有一定代表性的样品，供分析化验用。样品的采集一般包括三个内容：抽样取样：液体试样，固体试样制样。,采样数量应能反映该食品的卫生质量和满足检验项目对试样量的需要，一般为三份，供检验、复验与备查或仲裁用，每一份不少于0.5kg。采样一般步骤为：原始样的采集；原始样的混合；缩分原始样至需要的量。对于不同的样品应采用不同的方法进行样品的采集。,(1)溶剂萃取法利用被测物与干扰物溶解性的不同将它们分开。如脂肪的测定，常用有机溶剂抽提脂肪，然后再用质量法测定。(2)有机质分解法利用高温处理，将样品中的有机质氧化分解，其中碳、氢、氧元素以二氧化碳和水逸出，被测的金属元素等成分被释放出来，以利进一步测定。具体方法有干法灰化和湿法消化两种。,2、样品的处理,干法灰化是将试样放置在坩埚中，先在低温下小火炭化，除去水分、黑烟后，再在高温炉中以500600的高温灰化至无黑色炭粒。湿法消化是在强酸性溶液中，利用硫酸、硝酸、过氧化氢等氧化剂的氧化能力使有机质分解，被测的金属以离子状态最后留在溶液中，溶液经冷却定容后供测定用。,(3)蒸馏法蒸馏法是利用被测物质中各组分挥发性的差异来进行分离的方法。既可以用于除去干扰组分，也可以用于被测组分蒸馏逸出，收集馏出液进行分析。(4)盐析法利用向溶液中加入某种无机盐，使溶质在原溶剂中的溶解度大大降低，而从溶液中沉淀析出，这种方法叫做盐析。,(5)化学分离法1)磺化法和皂化法2)沉淀分离法3)掩蔽法(6)澄清和脱色澄清是用来分离样品中的混浊物质，以消除其对分析测定的影响。(7)色层分离法(8)浓缩,同一检验项目如有两个或两个以上检验方法时，要依据适用范围选择适宜的方法，但以第一法为仲裁法。一般样品在检验结束后应保留一个月，以备需要时复查，保留期限从检验报告单签发日起计算；易变质食品不予保留。保留样品应加封存放在适当的地方，并尽可能保持原状。,3、样品的分析检测,分析结果应准确记录，并按规定的方法进行处理，用正确的方式表示，才能确保分析结果的最终正确性。对于结果的表述，平行样的测定值报告其算术平均值，一般测定值的有效数的位数应能满足标准的要求，甚至高于标准，报告结果应比标准多一位有效数字，如铅卫生标准为1；报告值应为1.0mg/kg。样品测定值的单位，应与标准一致。常用单位有：g/kg，g/L，mg/kg，mg/L，g/kg，g/L等。,4、分析结果的记录与处理,第五讲食品检验的有关要求,1、检验方法的一般要求(1)称取是指用天平进行的称量操作，其精度要求用数值的有效数位表示，如“称取20.0g”指称量的精度为0.1g；“称取20.00g”指称量的精度为0.01g。(2)准确称取是指用精密天平进行的称量操作，其精度为0.0001g。(3)恒量是指在规定的条件下，连续两次干燥或灼烧后称定的质量差异不超过规定的范围。,(4)量取是指用量筒或量杯取液体物质的操作，其精度要求用数值的有效数位表示。(5)吸取是指用移液管、刻度吸量管取液体物质的操作。其精度要求用数值的有效数位表示。(6)空白试验是指除不加样品外，采用完全相同的分析步骤、试剂和用量(滴定法中标准滴定液的用量除外)，进行平行操作所得的结果。用于扣除样品中试剂本底和计算检验方法的检出限。,2、试剂的要求及其溶液浓度的基本表示方法检验方法中所使用的水，未注明其它要求时，均指蒸馏水或去离子水。未指明溶液用何种溶剂配制时，均指水溶液。检验方法中未指明具体浓度的硫酸、硝酸、盐酸、氨水时，均指市售试剂规格的浓度。,1)以标准浓度(即物质的量浓度)表示：其定义为单位体积溶液中所含有溶质的物质的量，单位为mol/L。2)以比例浓度表示：即以几种固体试剂的混合质量份数或液体试剂的混合体积份数表示，可记为(1+1)、(4+2+1)等形式。3)以质量(体积)分数表示：是以溶质占溶液的质量分数或体积分数表示，可记为或。4)如果溶液浓度以质量、容量单位表示，可表示为克每升或以其适当分倍数表示(g/L或mg/mL等)。,3、配制溶液的要求配制溶液时所使用的试剂和溶剂的纯度应符合分析项目的要求。一般试剂用硬质玻璃瓶存放，碱液和金属溶液用聚乙烯瓶存放，需避光试剂贮于棕色瓶中。,第六讲食品检验溶液的配制,一、样品的称量1.称重用直接称量法、指定质量称样法或差减称量法进行称量。2.量体积用量筒或量杯量取液体体积(精确到0.1mL)。用移液管或吸量管移取液体体积(精确到0.01mL)，用于精确量取。,二、溶液浓度的配制方法配制一般试剂溶液时，固体试剂用托盘天平称量，称量的器皿通常用表面皿或烧杯；液体试剂及溶剂用量筒量取。有时，溶液的体积还可根据所用的烧杯、试剂瓶的容积来估计。称出的固体试剂，于烧杯中先用适量水或溶剂溶解，再稀释至所需的体积。试剂溶解时若有放热现象，或以加热溶解时，应待冷却后，再转入试剂瓶中。配好的溶液，应马上贴好标签，注明溶液的名称、浓度和配制日期。,易水解的盐，配制溶液时，需加入适量的酸，再用水或稀酸稀释。易被氧化或还原的试剂，常在使用前临时配制，或采取措施，防止氧化或还原。易腐蚀玻璃的溶液，不能盛放在玻璃瓶内，如氟化物应保存在聚乙烯瓶中。装苛性碱的玻璃瓶应用橡胶塞，最好盛于聚乙烯瓶中。,配制指示剂溶液时，需称取的指示剂量很少，可用分析天平称量。根据指示剂的性质，采用合适的溶剂，必要时还要加入适当的稳定剂，并注意保存期。配好的指示剂一般贮存于棕色瓶中。经常并大量使用的溶液，可先配制成使用浓度10倍的储备液，需要用时取储备液稀释10倍即可。,1.按质量(体积)分数配制(1)用固体溶质按质量分数配制溶液计算所需溶质的质量，在托盘天平上称量，放入烧杯中。再求出溶剂的质量，称量溶剂，倒入烧杯中，使溶质溶解。(2)用液体溶质按质量(体积)分数配制溶液根据所配制的稀溶液的量，计算所需浓溶液试剂的量。配制方法有两种：一种是称取液体溶质的质量；另一种是量取液体溶质的体积，再加入所需溶剂即可。,2.按比例浓度配制(1)容量比(V+V)液体试剂相互混合或用溶剂稀释时的表示方法。如(1+4)的H2SO4，是指1单位体积的浓硫酸与4单位体积的水相混合。(2)质量比(m+m)固体试剂相混合时的表示方法。如配制(1+100)的紫脲酸胺NaCl指示剂50g，即取0.5g紫脲酸胺于研钵中，再取经100干燥过的NaCl50g，充分研细、混匀即可。,举例1：配制（1+4）的硫酸溶液500mL,用量筒量取100mL浓硫酸慢慢加入到400mL水中，边加边搅拌。以便释放产生的大量的热。冷却后，装入试剂瓶中，贴上标签，备用。,浓硫酸,水中,绝对不能将水加到硫酸中！,例2：配制0.5mol/L的氢氧化钠标准溶液500毫升。,第一步：计算大约应称取固体氢氧化钠重量为多少克（g）,第二步：称量分析纯的氢氧化钠固体10g。,第三步：固体药品在烧杯中，加适量水，搅拌，溶解。,第四步：用水稀释到500mL刻度。第五步：冷却后，装入试剂瓶，贴上标签，备用,例如：配制0.5mol/L的氢氧化钠标准溶液500毫升。,续,第七讲食品检验结果的处理,1、常用计量单位(1)质量单位：mg,g,kg.(2)容量单位(体积单位):mL,L.(3)浓度单位:mol/L,mg/L,mg/mL.2、被测组分含量的表示方法(1)质量分数(w)、体积分数()是分析结果最常用的表示方法之一。如：啤酒中的酒精的质量分数w(酒精)=3.64；白酒中酒精的体积分数(酒精)=40.0。(2)质量浓度常用单位为mg/L或g/mL；以及g/L或ng/mL。如白酒中铅离子的浓度为0.3mg/L，双乙酰的浓度为0.1mg/L等。,3、分析结果的准确度和精密度准确度和误差(1)误差误差是指测定值与真实值之间的差值。误差根据其产生的原因可分为系统误差和偶然误差两种。1)系统误差：系统误差是指经常反复的，且向同一方向发展的误差，这种误差的大小是可测的，所以又叫做可测定误差。主要来源于方法误差、仪器误差、试剂误差和操作者的主观误差。2)偶然误差：偶然误差是由于未知的因素引起的误差，其大小和方向都不可测定，又叫做不可测定误差。主要来源于分析过程中的一些偶然的、暂时不能控制的因素所引起的误差。,(2)准确度准确度是指测定值与实际值相符合的程度，常用误差来表示。误差越小，说明测定值的准确度越高。准确度反映测定值的准确性与真实性。有两种表示方法：绝对误差测定值与真实值之间的差值。相对误差绝对误差在真实值中所占的百分率。,精密度和偏差(1)偏差偏差是指单次分析结果与多次分析结果的平均值之差，可分为绝对偏差和相对偏差。绝对偏差单次测定值与测定平均值的差值。相对偏差单次测定绝对偏差的绝对值在平均值中所占的百分率。(2)精密度精密度是指对同一样品多次测定，测定值的相互接近程度。常用偏差表示分析结果的精密度。偏差越小，平行测定的测得值越接近，精密度越好。,4、有效数字的意义和位数有效数字实际上能测量得到的数字。它由全部准确数字和最后一位不确定数字组成。,23.43、23.42、23.44mL,最后一位无刻度，估计的，不是很准确，但不是臆造的，称可疑数字。*记录测定结果时，只能保留一位可疑数字。,17,质量：m台秤(称至0.1g):12.8g(3),0.5g(1),1.0g(2)分析天平(称至0.1mg):12.8218g(6),0.5024g(4),0.0500g(3)体积：V滴定管(量至0.01mL):26.32mL(4),3.97mL(3)容量瓶:100.0mL(4),250.0mL(4)移液管:25.00mL(4);量筒(量至1mL或0.1mL):26mL(2),4.0mL(2),记录分析结果的有效数字要求：,数字修约规则：,四舍六入五成双,5后面为0，看能否成双,5后面不为0，入,1.尾数4，舍。3.24633.2,2.尾数6，入。3.24633.25,3.尾数5,5后面为0,5前偶数，舍。3.60853.608,5前奇数，入。3.60753.608,5后面不为0，入,3.6085000013.609,3.6075000013.608,4.修约数字一次到位。2.5491,2.52.552.6,20,例题：SiO2的质量分数（%）为：37.40，37.20，37.30，37.50，37.30。计算平均值，平均偏差，相对平均偏差，标准偏差和相对标准偏差。,食品微生物学检测,概论,微生物(microbe，microorganism)通常是描述一切不借助显微镜用肉眼看不见的微小生物。这类微生物包括病毒、细菌、古菌、真菌、原生动物和某些藻类。,微生物形态、大小和细胞类型,微生物的种类,具有细胞结构的微生物,没有细胞结构的微生物：病毒,原核生物：（由原核细胞构成的）,真核微生物（由真核细胞构成的）,真菌显微藻类原生动物,细菌,草履虫,水绵,放线菌,个体微小，结构简单在形态上，个体微小，肉眼看不见，需用显微镜观察，细胞大小以微米和纳米计量。繁殖快生长繁殖快，在实验室培养条件下细菌几十分钟至几小时可以繁殖一代代谢类型多，活性强。分布广泛有高等生物的地方均有微生物生活，动植物不能生活的极端环境也有微生物存在。数量多在局部环境中数量众多，如每克土壤含微生物几千万至几亿个。易变异相对于高等生物而言，较容易发生变异。在所有生物类群中，已知微生物种类的数量仅次于被子植物和昆虫。微生物种内的遗传多样性非常丰富。,微生物生物的特点,细菌的基本形态和结构,细菌是一种具有细胞壁的单细胞生物。细菌的大小以微米（m）为测量单位（一微米等于千分之一毫米）。根据细菌形态一般分为球菌、杆菌、螺旋菌三大类。细菌具有细胞壁、细胞膜、细胞质、细胞核、核糖体和内含物等基本结构。细菌的特殊结构有荚膜、鞭毛、菌毛、芽孢等。,有害微生物对食品的危害及防止,微生物引起的食品有害因素主要是食品的腐败变质，因而使食品的营养价值降低或完全丧失。有些微生物是使人类致病的病原菌，有的微生物可产生毒素。如果人们食用含有大量病原菌或含有毒素的食物，则可引起食物中毒，影响人体健康，甚至危及生命。所以食品微生物学工作者应该设法控制或消除微生物对人类的这些有害作用，采用现代的检测手段，对食品中的微生物进行检测，以保证食品安全性。,食品微生物安全标准体系,基础标准（GB29921-2013食品安全国家标准食品中致病菌限量）检验方法（GB4789：基本要求、采样方案、检验方法）生产规范（GB14881-2013食品安全国家标准食品生产通用卫生规范）,6、阪崎肠杆菌,GB107652010食品安全国家标准婴儿配方食品,标准的采样方案,参考国际食品微生物标准委员会中各种致病菌的生物学特征描述，分析致病菌对各类食品可能产生的风险，分别采用了二级或三级采样方案。,食品微生物实验室的基本要求GB4789.12010食品安全国家标准食品微生物学检验总则NationalfoodsafetystandardFoodmicrobiologicalexamination:Generalguidelines,3.1环境3.2人员3.3设备3.4检验用品3.5培养基、试剂及菌种,3.1环境3.1.1实验室环境不应影响检验结果的准确性。3.1.2实验室的工作区域应与办公室区域明显分开。3.1.3实验室工作面积和总体布局应能满足从事检验工作的需要，实验室布局应采用单方向工作流程，避免交叉污染。3.1.4实验室内环境的温度、湿度、照度、噪声和洁净度等应符合工作要求。3.1.5一般样品检验应在洁净区域包括超净工作台或洁净实验室进行，洁净区域应有明显的标示。3.1.6病原微生物分离鉴定工作应在二级生物安全实验室（Biosafetylevel2,BSL-2）?进行。,3.2人员3.2.1检验人员应具有相应的教育、微生物专业培训经历，具备相应的资质，能够理解并正确实施检验。3.2.2检验人员应掌握实验室生物检验安全操作知识和消毒知识。3.2.3检验人员应在检验过程中保持个人整洁与卫生，防止人为污染样品。3.2.4检验人员应在检验过程中遵守相关预防措施的规定，保证自身安全。3.2.5有颜色视觉障碍的人员不能执行涉及到辨色的实验。,3.3设备3.3.1实验设备应满足检验工作的需要。3.3.2实验设备应放置于适宜的环境条件下，便于维护、清洁、消毒与校准，并保持整洁与良好的工作状态。3.3.3实验设备应定期进行检查、检定（加贴标识）、维护和保养，以确保工作性能和操作安全。3.3.4实验设备应有日常性监控记录和使用记录。,微生物检测设施、设备一览,超净工作台或生物洁净室微生物培养箱（361等）天平：（感量0.1g，0.01g）电热干燥箱（干热灭菌）高压灭菌锅（湿热灭菌）生物安全柜（最重要的安全设备，形成最主要的防护屏障）显微镜水浴锅、冰箱、冰柜,3.4检验用品3.4.1常规检验用品主要有接种环（针）、酒精灯、镊子、剪刀、药匙、消毒棉球、硅胶（棉）塞、微量移液器、吸管、吸球、试管、平皿、微孔板、广口瓶、量筒、玻棒及L形玻棒等。3.4.2检验用品在使用前应保持清洁和/或无菌。常用的灭菌方法包括湿热法、干热法、化学法等。3.4.3需要灭菌的检验用品应放置在特定容器内或用合适的材料（如专用包装纸、铝箔纸等）包裹或加塞，应保证灭菌效果。3.4.4可选择适用于微生物检验的一次性用品来替代反复使用的物品与材料（如培养皿、吸管、吸头、试管、接种环等）。3.4.5检验用品的储存环境应保持干燥和清洁,已灭菌与未灭菌的用品应分开存放并明确标识。3.4.6灭菌检验用品应记录灭菌/消毒的温度与持续时间。,3.5培养基和试剂3.5.1培养基培养基的制备和质量控制按照GB/T4789.28的规定执行。3.5.2试剂检验试剂的质量及配制应适用于相关检验。对检验结果有重要影响的关键试剂应进行适用性验证。3.6菌株3.6.1应使用微生物菌种保藏专门机构或同行认可机构保存的、可溯源的标准或参考菌株。3.6.2应对从食品、环境或人体分离、纯化、鉴定的，未在微生物菌种保藏专门机构登记注册的原始分离菌株（野生菌株）进行系统、完整的菌株信息记录，包括分离时间、来源，表型及分子鉴定的主要特征等。3.6.3实验室应保存能满足实验需要的标准或参考菌株，在购入和传代保藏过程中，应进行验证试验，并进行文件化管理。,微生物检验人员的工作规范,无菌操作生物安全,无菌操作（彻底灭菌、防止污染）,无菌及无菌操作的概念：无菌是指在环境中一切有生命活动的微生物的营养细胞及其芽孢或孢子都不存在的状态。无菌操作是指在无菌环境下进行的细胞传代培养、植物组织培养、细菌接种等操作,目的是防止微生物进入人体组织或其他无菌范围。泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。无菌环境（无菌室、超净工作台）无菌材料（培养基和试剂、器皿、用具的灭菌）防止污染，保持无菌状态,无菌室,、无菌室应完全封闭，进出无菌室至少要经两道门，中间隔有缓冲间，无菌室与外间设置一个可开闭的窗口，用于传递器具。,、无菌室必须保持整洁。工作人员进入无菌室应换专用鞋、专用衣。无菌室使用前须用紫外线消毒30min，操作结束后清洁台面，再用紫外线消毒30min。定期用乳酸或甲醛熏蒸，彻底消毒。,、无菌室仅用于培养基分装等无菌操作，不能进行有菌标本的操作。操作人员操作时应严格关门，并戴好专用的手套、口罩、帽子、防护服等个人防护装备、无菌室内应有空气过滤装置，并安装空调。,微生物检验人员的工作规范,无菌操作要求食品微生物实验室工作人员，必须有严格的无菌观念，微生物实验的许多试验要求在无菌条件下进行，主要原因是防止试验操作中人为污染样品。1接种细菌时必须穿工作服、戴工作帽。2进行接种食品样品时，必须穿专用的工作服、帽及拖鞋，应放在无菌室缓冲间，工作前经紫外线消毒后使用。3接种食品样品时，应在进无菌室前用肥皂洗手，然后用75酒精棉球将手擦干净。4进行接种所用的吸管，平皿及培养基等必须经消毒灭菌，打开包装未使用完的器皿，不能放置后再使用，金属用具应高压灭菌或用95%酒精点燃烧灼三次后使用。5从包装中取出吸管时，吸管尖部不能触及外露部位，使用吸管接种于试管或平皿时，吸管尖不得触及试管或平皿边。6接种样品、转种细菌必须在酒精灯前操作，接种细菌或样品时，吸管从包装中取出后及打开试管塞都要通过火焰消毒。7接种环和针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属丝，必要时还要烧到环和针与杆的连接处。8吸管吸取菌液或样品时，应用相应的橡皮头吸取，不得直接用口吸。,微生物检验人员的工作规范,9无菌间使用要求1）无菌间内应保持清洁，工作后用消毒液擦拭工作台面，不得存放与实验无关的物品。2)无菌间使用前后应将门关紧，打开紫外灯，如采用室内悬吊紫外灯消毒时，需30W紫外灯，距离在1.0m处，照射时间不少于30min，灯管每隔两周需用酒精棉球轻轻擦拭，除去上面灰尘和油垢，以减少紫外线穿透的影响。处理和接种食品标本时，进入无菌间操作，不得随意出入，如需要传递物品，可通过传递窗传递。定期对无菌间进行沉降菌的监测和记录。,检查无菌操作是否规范的直接方法-空白对照,根据GB4789.2菌落总数测定，将营养琼脂培养基倾入加有1ml灭菌生理盐水灭菌培养皿内作空白对照。空白对照的结果至少可以说明三个问题：（1）实验所使用的材料灭菌是否彻底，储存是否合理得当。（2）无菌室的空气条件是否达到要求。（3）操作人员的无菌操作技术是否规范。由此可见，通过空白对照可直接检验实验器皿、实验条件以及实验人员是否符合无菌操作的规定。如果从空白对照中看出无菌操作不规范，通过实验进一步找出原因所在，最终达到规范的无菌操作。,微生物检验的基本知识,一、培养基的配制与灭菌二、微生物的显微镜检查,培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料。由于微生物具有不同的营养类型，对营养物质的要求也各不相同，加之实验和研究的目的不同，所以培养基的种类很多，使用的原料也各有差异，但从营养角度分析，培养基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、无机盐、生长素以及水分等。另外，培养基还应具有适宜的pH值、一定的缓冲能力、一定的氧化还原电位及合适的渗透压。,琼脂是从石花菜等海藻中提取的胶体物质，是应用最广的凝固剂。加琼脂制成的培养基在98100下融化，于45以下凝固。但多次反复融化，其凝固性降低。任何一种培养基一经制成就应及时彻底灭菌，以备纯培养用。一般培养基的灭菌采用高压蒸汽灭菌。,普通琼脂培养基,操作流程和步骤,1)称量及溶化,2)调pH,3)加琼脂、溶化、定容、（过滤）,4)分装、加塞、包扎,5)灭菌（高压蒸汽灭菌法）,培养基的制备1、称量药品:根据培养基配方依次准确称取各种药品，放入适当大小的烧杯中，琼脂不要加入。蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。2、溶解：用量筒取一定量(约占总量的1/2)蒸馏水倒入烧杯中，在放有石棉网的电炉上小火加热，并用玻棒搅拌，以防液体溢出。待各种药品完全溶解后，停止加热，补足水分。如果配方中有淀粉，则先将淀粉用少量冷水调成糊状，并在火上加热搅拌，然后加足水分及其它原料，待完全溶化后，补足水分。,3、调节pH根据培养基对pH的要求，用5%NaOH或5%HCl溶液调至所需pH。测定pH可用pH试纸或酸度计等。4、溶化琼脂固体或半固体培养基须加入一定量琼脂。琼脂加入后，置电炉上一面搅拌一面加热，直至琼脂完全融化后才能停止搅拌，并补足水分(水需预热)。注意控制火力不要使培养基溢出或烧焦。,5、过滤分装先将过滤装置安装好。如果是液体培养基，玻璃漏斗中放一层滤纸，如果是固体或半固体培养基，则需在漏斗中放多层纱布，或两层纱布夹一层薄薄的脱脂棉趁热进行过滤。过滤后立即进行分装。分装时注意不要使培养基沾染在管口或瓶口，以免浸湿棉塞引起污染。液体分装高度以试管高度的1/4左右为宜。固体分装装量为管高的1/5，半固体分装试管一般以试管高度的1/3为宜；分装三角瓶，其装量以不超过三角瓶容积的一半为宜。,培养基的分装（图中是利用培养基分装泵进行分装）,6、包扎标记培养基分装后加好棉塞或试管帽，再包上一层防潮纸，用棉绳系好。在包装纸上标明培养基名称，制备组别和姓名、日期等。7、灭菌上述培养基应按培养基配方中规定的条件及时进行灭菌。普通培养基为12120min，以保证灭菌效果和不损伤培养基的有效成份。培养基经灭菌后，如需要作斜面固体培养基，则灭菌后立即摆放成斜面，斜面长度一般以不超过试管长度的1/2为宜；半固体培养基灭菌后，垂直冷凝成半固体深层琼脂。8、倒平板将需倒平板的培养基，于水浴锅中冷却到4550,立刻倒平板,5.2灭菌方法和步骤灭菌是指杀死或消灭一定环境中的所有微生物，灭菌的方法分物理和化学灭菌法两大类。本次课主要介绍物理方法的一种，即加热灭菌。加热灭菌包括湿热和干热灭菌两种。通过加热使菌体内蛋白质凝固变性，从而达到杀菌目的。蛋白质的凝固变性与其自身含水量有关，含水量越高，其凝固所需要的温度越低。在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大，因为：(1)在湿热条件下，细菌吸收水分，使菌体蛋白质易于凝固变性。(2)温热蒸气的穿透力比干热空气强，能较快提高灭菌物品内部的温度。(3)热蒸气与物品接触，由气态变为液态时可放出大量潜热，能迅速提高灭菌物品的温度。,1湿热灭菌1、煮沸消毒法注射器和解剖器械等均可采用此法。先将注射器等用纱布包好，然后放进煮沸消毒器内加水煮沸。对于细菌的营养体煮沸约1530min，对于芽孢则需煮沸约12h。2、高压蒸汽灭菌法高压蒸汽灭菌用途广，效率高，是微生物学实验中最常用的灭菌方法。这种灭菌方法是基于水的沸点随着蒸汽压力的升高而升高的原理设计的。当蒸汽压力达到1.05kg/cm2时，水蒸气的温度升高到121，经1530min，可全部杀死锅内物品上的各种微生物和它们的孢子或芽孢。一般培养基、玻璃器皿以及传染性标本和工作服等都可应用此法灭菌。,3、操作方法和注意事项如下（1）加水打开灭菌锅盖，向锅内加水到水位线。立式消毒锅最好用已煮开过的水，以便减少水垢在锅内的积存。注意水要