细胞生物学教学课件第11章 细胞凋亡

第十三章细胞衰老和细胞凋亡,Chapter13cellsenescenceandApoptosis,机体结构,细胞增殖,细胞分化,细胞凋亡,细胞信号转导,染色体,（DNA与蛋白质的相互作用）,衰老,一、细胞衰老的概念,机体的形态、结构和生理功能逐渐衰退的总现象称为衰老(aging，senescence)。细胞衰老(cellsenescence)是指细胞在正常环境条件下发生的细胞生理功能和增殖能力减弱以及形态发生改变，并趋向死亡的现象。,3,机体衰老并不等于所有细胞的衰老，但机体的衰老是以细胞总体的衰老为基础的。社会老龄化与老年医学(gerontology)。,一般说来能保持持续分裂能力的细胞不容易衰老；而分化程度高、又不分裂的细胞寿命却是有限的，容易发生衰老和死亡。,（一）体内细胞存活的时间与细胞的种类有关,4,动物体细胞在体外可传代的次数与物种寿命有关,（二）体外培养细胞分裂次数与衰老,5,人胚的成纤维细胞：可持续分裂60-80次；40岁成人的成纤维细胞：可持续分裂40次；80岁老人的成纤维细胞：可持续分裂10-30次。,成纤维细胞的最高分裂次数与动物寿命有一定的比例关系,人：60-80次100150岁；,鸡：15-35次35年；,小鼠：14-28次23年；,龟：90-125次n100岁；,红杉树(redwood)（美国西部）：4,000多年,银杏树（安徽省徽县、山东省莒县）：3,000多年,植物细胞：,但也有些动物没有最高分裂次数，其细胞永远具有分裂能力，如鱼类和一些无脊椎动物(昆虫例外)。但无论它寿命有多长，但终究会衰老和死亡的。,无最高分裂次数永生!,（三）Hayflick界限,细胞是有一定的寿命的；它们的增殖能力不是无限的，而是有一定的界限，这就是著名的Hayflick界限(Hayflicklimitation)。,8,二、衰老细胞结构的变化,内质网的变化:衰老动物内质网成分弥散性地分散于核周胞质中，粗面内质网的总量似乎是减少了线粒体的变化:通常，细胞中线粒体的数量随年龄减少，而其体积则随龄增大致密体的生成,细胞核的变化体外培养的二倍体细胞，细胞核随着细胞分裂次数的增加不断增大细胞核的核膜内折（invagination）、染色质固缩化,质膜系统的变化衰老的细胞，其膜流动性降低、韧性减小衰老细胞间间隙连接,1.复制衰老的机制复制的次数是确定的-Hayflick界限1970年，的末端复制问题：聚合酶不能从头合成子链，复制母链端时，子链端与之配对的引物被切除后会产生末端缺失，导致子链端随着复制次数的增加而逐渐缩短。俄罗斯科学家认为复制不断缩短的末端可能是正常细胞有限分裂的原因。年，四膜虫的端粒序列与哺乳动物的端粒相似，可以对端粒的长度进行测算。年，研究证实细胞端粒长度随着分裂次数增加确实在不断缩短。年，获得端粒的缩短导致细胞缩短的直接证据。端粒酶的发现及端粒酶基因的导入。,三、细胞衰老的分子机理,2009年度诺贝尔生理学或医学奖授予三位美国科学家E.H.Blackburn、C.W.Greider和J.W.Szostak)，以表彰他们发现了端粒和端粒酶保护染色体的机理。,2.端粒长度与细胞衰老,11,Telomeres,ServesascapsforthelinearendofthechromosomePreventsDNAfrombeingdegradedPreventsrecombinationMadeupofrepeatingsequencesThe“EndReplicationProblem”,3,GATTGATGATAGATAGATTTCTAACTACTATCUAUCUAAA,5,3,RNAPrimer,5,GATTGATGATAGATAGATTTCTAACTACTAT,5,3,3,Shortenedend,5,12,细胞增殖次数与端粒DNA长度有关。Harley等1991发现体细胞染色体的端粒DNA会随细胞分裂次数增加而不断缩短，又称“有丝分裂钟”。细胞DNA每复制一次端粒就缩短一段(5-20bp)，当缩短到Hayflick点时，会启动DNA损伤检测点，激活p53，引起p21表达，导致不可逆地退出细胞周期，走向衰亡。,13,端粒的长度与端粒酶(telomerase)的活性有关，在精原细胞、干细胞和肿瘤细胞(如Hela细胞)中有较高的端粒酶活性，而正常体细胞中端粒酶的活性很低，呈抑制状态。端粒缩短能引起细胞衰老。,14,3.胁迫诱导的早熟性衰老许多刺激性因素如过量的氧、乙醇、离子辐射和丝裂霉素等均能够缩短细胞的寿命，促进细胞衰老，这种细胞衰老称为胁迫诱导的早熟性衰老（SIPS）。研究发现SIPS和RS（复制型衰老）的机制类似。均涉及p53-p21以及p16信号途径。,氧化性损伤学说：衰老现象是由生命活动中代谢产生的活性氧成分造成的损伤积累引起的。活性氧对生物大分子具有损伤作用清除自由基可以延长寿命。（线虫和果蝇）对于持续分裂的细胞，衰老机制与氧化损伤之间的关系还不清楚。,4.单细胞生物的衰老芽殖酵母的分裂是不均等分裂，衰老表现是有限的细胞分裂次数和母细胞在衰老之前经历的表型变化。目前认为，芽殖酵母的衰老由rDNA的变化决定。串联重复的rDNA（8号染色体，100-200拷贝），经同源重组形成rDNA环，游离于染色体外，不进入子细胞，仍积累于母细胞，随着细胞分裂次数不断增加，rDNA环增加。当积累到500-1000拷贝时，细胞衰老。推测，rDNA环的积累掠夺了DNA正常复制和转录所需的重要物质，抑制了细胞生长，促使细胞衰老。,5.细胞衰老与个体衰老和癌症的关系当前的细胞衰老特征与器官或组织的衰老尚不能统一起来。如，端粒在细胞衰老过程中的作用，小鼠和人类细胞得到的结论不尽相同，某些小鼠细胞的染色体端粒长度一直不缩短体外培养的细胞获得的结论还不能正确模拟出体内细胞的状态：环境不同（氧浓度不同、胰酶处理、三维环境和二维环境的不同）研究发现：若将RS和SIPS相关基因剔除或突变，小鼠并未表现出衰老，而是易发生癌症，推测衰老与癌症相关。,体内健康细胞在特定的细胞外信号的诱导下，其死亡途径被激活，于是在有关基因的调控下发生死亡，细胞的这种死亡方式称为程序化细胞死亡(programmedcelldeath)，又称细胞凋亡(apoptosis)。,第二节细胞凋亡,一、细胞凋亡的概念及生物学意义,对动物个体的正常发育，自稳态的维持，免疫耐受的形成，肿瘤监控等多种生理和病理过程具有重要意义.,细胞调亡的生物学意义：,发育过程中手和足的成形过程,脊椎动物的神经系统的发育,一种生理保护机制，清除体内多余、受损或危险的细胞而不对周围的细胞或组织产生危害。在成熟的动物个体中，通过细胞凋亡和细胞增殖速率的调节来维持组织器官细胞数量的稳定。,胸腺细胞,正常,凋亡,二、细胞凋亡的主要特征,三、细胞凋亡的特征,（一）形态学特征,1.细胞质及细胞器的变化细胞连接及微绒毛消失，膜完整。细胞质浓缩，线粒体增殖、空泡化，细胞膜反折包围细胞内的碎片，形成芽突。,23,2.细胞核的变化,细胞核染色质浓聚、固缩和裂解。细胞膜将细胞质内的细胞器及染色质的断片分割包围，形成的多个膜结构尚完整的泡状小体，称为凋亡小体（apoptoticbody）。,左，正常胸腺细胞；右，凋亡胸腺细胞(凋亡小体),24,正常白细胞和凋亡的白细胞,25,26,细胞凋亡在性质上与细胞坏死的对比图解,细胞坏死时，质膜破裂，细胞质溢出；,细胞凋亡，细胞质凝缩，但质膜仍保持完整,程序性细胞死亡与细胞坏死的区别,（二）细胞凋亡的生化特征,染色质DNA的降解是程序性细胞死亡的一个显著特征。细胞染色质DNA的特征性降解可作为细胞凋亡的一个重要的实验判断依据。内源性核酸内切酶基因的活化，染色质DNA降解，染色质DNA的断片大小都为180200bp的整数倍，因而在电泳时，呈现特征性的DNA梯状条带(DNAladders)。,1DNA片断化,29,细胞色素c诱导的凋亡细胞DNA电泳图1诱导0h2诱导1h3诱导2h4诱导3h5诱导4h6阴性对照7Marker,30,2.蛋白质降解,切冬酶(caspases)是一组存在于细胞溶胶中的结构上相关的，能特异地断开天冬氨酸残基后的肽键，活性中心含半胱氨酸的蛋白酶，能分解细胞蛋白，起凋亡执行器的作用。,31,三细胞凋亡的检测,形态学观测：染色法（台盼兰、DAPI）、透射和扫描电镜观察DNA电泳：DNA片段就呈现出梯状条带TUNEL测定法，即DNA断裂的原位末端标记法，对DNA分子断裂缺口中的3-OH进行原位标记。彗星电泳法（cometassay）流式细胞分析检测细胞膜成分变化细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸翻转至细胞膜外侧,四诱导细胞凋亡的因子,物理性因子，包括射线（紫外线，射线等），较温和的温度刺激（如热激，冷激）等化学及生物因子：包括活性氧基团和分子，DNA和蛋白质合成的抑制剂，激素，细胞生长因子，肿瘤坏死因子（TNF），抗Fas/Apo-1/CD95抗体等,Caspase的研究首先是在秀丽隐干线虫细胞的凋亡开始的，从胚胎发育至成体，线虫共产生了1090个体细胞，其中131个体细胞凋亡。研究发现ced3,ced4基因促进细胞凋亡，ced9基因阻止ced3/ced4的激活，抑制细胞凋亡。,2002年美国麻省理工学院的Roberthorvitz,英国的SydneyBrenner和JohnE.Sulston因在线虫细胞凋亡方面的创新性研究共同获得诺贝尔医学和生理学奖。,SydneyBrennerH.RobertHorvitzJohnE.Sulston,第三节细胞的凋亡机制,细胞凋亡大致分为四个生化反应阶段。凋亡信号转导阶段。凋亡基因激活阶段。细胞凋亡的执行阶段。凋亡细胞的消除阶段。,35,（一）细胞凋亡的途径与过程,细胞凋亡发生过程的形态学阶段,1.诱导凋亡期：诱导因素，信号传导2.执行期：启动凋亡，凋亡小体3.消亡期：被吞噬,36,1.切冬酶的性质和作用切冬酶(caspases)：在蛋白质水解酶级联途径中具有专一性切割蛋白质分子中的Asp-X肽键活性的半胱氨酸蛋白酶系。全称为天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白质水解酶。又被称为胱冬肽酶,（二）细胞凋亡相关的基因和蛋白质,在哺乳类动物细胞中caspase家族共有15个成员，又分为两类：一类为执行者(executioner或effector)，如caspase-3、6、7，可直接降解胞内的结构蛋白和功能蛋白，引起凋亡；另一类为启动者(initiator)，如caspase-8、9，受到信号后，能通过自剪接而激活，然后引起caspase级联反应，如caspase-8可依次激活caspase-3、6、7。,38,Caspase通过切割底物发挥作用，如Caspase激活的DNA酶在核小体间切割DNA，形成间隔200bp的DNA片段；执行caspase切割核纤层蛋白，核纤层解聚，使细胞呈现出凋亡的形态学和分子生物学特征。,DNAladder,39,2.抑癌基因在细胞凋亡中的作用,多数抑癌基因促进细胞凋亡(p53基因等)。,40,3.bcl-2基因,Bcl-2家族的特点是：家族成员有的可诱导凋亡(Bax、bcl-xs、Bad、Bak、Bid、Bik)；有的可阻止细胞凋亡的发生(bcl-2、bcl-xl、bcl-w、Mcl-1)。,4.一些原癌基因在细胞凋亡中发挥重要作用,c-myc基因：能促进细胞的增殖，也能诱导细胞凋亡。H-ras基因：编码p21蛋白，促进细胞的增殖，抑制细胞凋亡。,41,5.可触发细胞凋亡的fas和fasL,fas又称Apo-1,即CD95分子，是肿瘤坏死因子受体及神经生长因子受体家族成员。fas是细胞表面的凋亡信号受体，存在于多种动物细胞表面。fas与fas配体(fasligand，fasL)相互作用，可导致表达fas的细胞凋亡发生。,42,fas与fas配体(fasligand,fasL)相互作用，可导致表达fas的细胞凋亡发生。,1.死亡受体介导的细胞凋亡,fas/fasLFADDcaspase-8（启动者）caspase-3（执行者）细胞凋亡,FADD：fas相关死亡结构域,（三）细胞凋亡的发生机制,43,死亡受体TNF-R1和Fas（Apo-1，CD95），胞质部分含有死亡结构域（DD），负责招募凋亡信号通路中的信号分子。,Fas与配体（如TNF）结合发生三聚化，使胞内的DD区（Deathdomain）与接头蛋白FADD的DD区结合。FADDN端通过DED区（deatheffectordomain）与Caspase-8前体蛋白和CAP3结合，激活Caspase-8。,2.线粒体细胞凋亡途径,线粒体膜通透性转换孔（PTP）改变,释放细胞色素C，细胞色素C与caspase-9前体、ATP/dATP形成凋亡复合体，然后召集并激活caspase-3，进而引发caspase级联反应，对凋亡信号进行放大，导致细胞凋亡。,45,3.Caspase非依赖性的细胞凋亡Caspase非依赖性的细胞凋亡确实存在，但机制仍不完全清楚。凋亡诱导因子（AIF）位于线粒体外膜，可