病毒TCID50测定

病毒TCID50测定(一半组织感染)操作步骤(1)细胞准备取出一个细胞培养盘，每个孔就能输送大约8000到10000个细胞(T25瓶的细部分)细胞消化后添加10ml培养液，必须准确传递96孔板。每个孔细胞都被铺成一层，富含约60%，可以接种病毒(下午好的板第二天早上就可以使用)。选择细胞对照16个孔就可以了。适当和对照组可在培养基上进行，注意不要在操作中频道。每个都可以在不同的细胞培养板上进行，但要确保实验条件一致。(2)稀释要测试的病毒溶液。a法是参考书的标准操作方法b方法参考书液体量减少结果病毒稀释液根据胰蛋白酶的需要选择合适的液体，但两者都没有血清。a在每个试管中添加1.8毫升病毒稀释剂。在试管1号中添加0.2毫升病毒，以10倍的顺序用适当浓度稀释的最后试管。b病毒原液(10-1，10-2.10-10等)比EP管中无血清培养液多使用10倍，根据病毒的近似效价确定稀释倍数。第一次滴定可以再稀释几滴。根据接种的孔数稀释病毒，通常每稀释接种4孔，每稀释度为500l，即10-1 50l，添加450l的培养液；每稀释度接种8个孔时，分别制造1毫升。也就是说，10-1在100l中加入900l的孵化液。接种8个孔后，液体量相应增加。这种液体不是固定不变的，可以根据接种量自行调整。有天！使用此步骤的注意事项：1)建议每稀释度接种8个孔，为进行统计分析，应增加到16个孔。2)在病毒稀释过程中，一定要将病毒液和培养液充分混合。2)此过程需要使用取样器和tip头。使用前用75%乙醇擦拭取样器，用紫外线照射20分钟，确保灭菌。使用新的高压tip头时，外部包装必须位于超净工作站(或在安全机柜中打开)。成语(3)免疫取细胞培养板，用多道配方机(也称为行枪)吸出96孔板的培养液，吸收孵化液，在每个孔中再轻轻吹一次，去除孵化液(因为血清会妨碍病毒吸附)。将稀释后的病毒液体添加到96孔板，每个孔100l，根据观察到的习惯，通常从右到左，从上到下，从高稀释度到低稀释度(10-1，10-2)到原液添加样品。【记住：设定正常的细胞控制。每个实验重复四次，以计算标准偏差。成语在37 的CO2培养基中孵化1h，取出培养板，去除病毒溶液(在低浓度下高浓度拖动可避免窜流)，添加200l维持液，在37 的CO2培养基中继续培养。(4)培养把培养板放在CO2培养箱里。培养温度，培养天空。(5)测量结果取出培养板，用显微镜观察细胞病变。计算方法1) Spearman-Karber方法Lgccid 50/0.2ml=-(x0-d/2 d R1/n1)X0=所有病变最小稀释对数D=稀释系数对数N1=每稀释度的孔数R1=病变孔数=乘积和LgCCID50 /ml=LgCCID50 /0.2ml 0.72) Reed-Muench方法观察CPE，找出能引起细胞病或管感染一半的病毒稀释倍数，计算该病毒溶液的TCID50能使50%的细胞管成为病变的病毒稀释度在10-4-10-5之间，其间的距离比率由Reed和Muench公式计算。TCID50=病变超过50%的病毒最大稀释度的对数距离比结果50%的细胞管病变为病毒稀释10-4.5，即TCID50为104.5倍，病毒悬浮液稀释104.5倍，0.1毫升包含1个TCID5