光学显微镜的结构与使用方法

光学显微镜的结构和使用方法【目的要求】1 .熟悉光学显微镜的主要结构和性能；2 .掌握低倍镜和高倍镜的使用方法。3 .初步掌握油镜的使用方法。4 .了解光学显微镜的维护方法。【实验原理】光学显微镜(light microscope )是生物科学和医学研究领域常用的仪器，广泛用于细胞生物学、组织学、病理学、微生物学和其他相关学科的教学研究，是研究人体和其他生物生物组织和细胞结构的有力工具。光学显微镜简称为光学镜，是利用光线照明在微小物体上形成放大图像的仪器。 现在使用的光镜种类很多，外形和构造的差别很大。 有些类型的光镜有暗视场显微镜、荧光显微镜、相位差显微镜、倒置显微镜等特殊用途，但其基本结构和工作原理相似。 普通的光学反射镜主要由机械系统和光学系统两部分构成，光学系统主要由光源、反射镜、聚光器、物镜和目镜等部件构成。光镜是怎样放大微小物体的呢？物镜和目镜的构造很复杂，但其作用相当于凸透镜，因为被检测样本位于物镜下方的12倍焦距之间，所以形成了向上倒立的放大实相，该实相位于目镜的下焦点(焦平面)内，目镜用显微镜放大的倒立虚像与直立在视网膜上的实像一致，这个虚像在距离眼睛25cm的地方能看到。分辨率是光镜的主要性能指示。 所谓分辨率或分辨率，是指在显微镜或人眼为25cm的明视距离下，能够明确识别被检体的微细构造的最小间隔的能力，即能够识别在标本上相互接近的2点间的最小距离的能力。 据测量，人眼的分辨率约为100 m。 显微镜的分辨率由物镜的分辨率决定，物镜的分辨率由显微镜的分辨率决定，目镜与显微镜的分辨率无关。 反射镜的分辨率(R)(R值越小分辨率越高)可通过下式计算其中，n是聚光透镜与物镜之间的介质的折射率(空气为1，油为1.5 )，q是样品的物镜的开口角的半角，sin的最大值为1，l是照明光源的波长(白色光约为0.5m )。 放大率或放大率是光学反射镜性能的另一个重要参数，并且显微镜的总放大率等于目镜的放大率与物镜的放大率之积。一、光学显微镜的基本结构和功能(1)机械部分1、镜筒：是安装在反光镜最上方或镜臂前方的圆筒状结构，其上端安装有目镜，下端连接有物镜转换器。 根据镜筒的数量，光学镜分为单筒式和双筒望远镜式两种。 单筒光学镜有立式和倾斜式两种。 双筒望远镜的镜筒是倾斜的。 镜筒直立反射镜的目镜和物镜的中心线相互成45度角，镜筒上安装了使光折射45度的棱镜。2 .物镜转换器：也称为物镜转换盘。 安装在镜筒下方的圆盘状结构，可顺时针或逆时针自由旋转。 其上均匀分布着34个圆孔，搭载了不同倍率的物镜。 旋转物镜切换盘时，不同的物镜到达动作位置(与光路对应的轴)。 使用时请确保手感能够正确定位所需的物镜。3、镜臂：为了支撑镜筒和载物台的弯曲状构造，用显微镜把持的部位。 镜筒立式光镜在镜筒臂与其下方的镜柱之间具有倾斜关节，容易将镜筒向后方倾斜一定角度进行观察，但如果倾斜角度不超过45度使用，则显微镜容易因重心偏移而倾倒。 使用临时薄板时，切勿倾斜反射镜臂，以免液体或染液流出或污染显微镜。4、调焦器：也称为调焦螺旋，作为调节焦距的装置，位于镜臂的上端(镜筒直立式光学镜)或下端(镜筒倾斜式光学镜)，分为粗调节螺旋(大螺旋)和细调节螺旋(小螺旋)两种。 粗调螺旋可使镜筒或载物台快速或大幅度升降，快速调整焦距，将对象映入视野，适用于低倍镜观察时的焦点调节。 细螺旋只能使镜筒或载物台缓慢或小幅升降(用肉眼难以观察到升降距离)，适合高倍镜与油镜对焦，或观察标本的不同层次，一般在粗螺旋对焦的基础上使用细螺旋，细微调节焦距。一些类型的光镜，粗调螺旋和细调螺旋重叠，安装在镜柱的两侧。 在左右的粗调整螺钉的内侧，有被称为粗调整转盘的细环，具有调整粗调整螺钉的紧固的功能。 另外，在左侧的粗调螺旋的内侧具有用粗调螺旋调整焦距后，将该柄向上推而限制粗调螺旋的粗调螺旋凸轮柄，此时，载物台无法进一步上升，但能够调整微调旋转。5、阶段：也称为阶段，是物镜变换器下方的方形阶段，放置所观察到的玻璃标本的场所。 在平台的中央有一个被称为光通过孔的圆孔，来自下方的光通过该孔照射到标本上。6、镜柱：连接镜臂和镜座的短柱。7、镜座：显微镜最下面的结构是整个显微镜的基座，用于支撑镜体使其稳定。 也有在镜座内置照明光源等的显微镜。(2)光学系统部分光学反射镜的光学系统主要由物镜、目镜、照明装置(反射镜、聚光器、光圈等)构成。1、目镜：也称为目镜，安装在镜筒的上端，发挥进一步放大由物镜放大的物体像的作用。 各目镜通常由2个透镜构成，在上下2个透镜(目镜和聚光透镜)之间安装决定视场大小的金属光圈33、354视场光圈。 由于该光圈的位置是物镜放大实像的位置，因此能够使短头发附着在光圈上，指示其他人能够观察视野的一部分。 另外，也可以在光圈上安装接近检测测微计。 每个显微镜通常配置23个不同倍率的目镜，一般有5、10、15 (表示倍率)的目镜，可以根据需要选择使用，最常用的是10目镜。2、物镜：又称物镜，安装在物镜转换器上。 每个物镜通常具有3至4个不同放大率的物镜，其中每个物镜由多个凸透镜和凹透镜组合构成，它们是显微镜的最主要的光学组件，并且确定物镜的分辨率的水平。 常用的物镜的倍率有10、40、100等几个。 一般将8或10个物镜称为低倍镜(5以下称为放大镜)。 将40或45个镜头称为高倍镜的90或100个镜头称为油镜(此镜头在使用时必须浸入油中)。各物镜通常刻有反映其主要性能的参数，主要有倍率和数值孔径(例如10/0.25、40/0.65和100/1.25 )、该物镜所需的镜筒的长度和标本上的玻璃盖的厚度(160/0.17、单位mm )等油镜在使用时必须以芳香沥青和石蜡油为介质。 这是因为油镜的透镜和反射镜孔小，光通过载玻片和空气进入物镜，由于玻璃和空气的折射率不同，一部分光折射失去，进入物镜的光减少，视野暗，物体像不清楚。 在玻璃标本和油镜之间填充折射率接近玻璃的香沥青和石蜡油(玻璃、香沥青和石蜡油的折射率分别为1.52、1.51、1.46，空气为1 )，可以减少光线折射，增加视野亮度，提高分辨率。 物镜的分辨率的大小是物镜的数值孔径(numerial aperture，N.A.)，N.A .也称为透镜率，其数值越大表示分辨率越高。图1-3物镜的性能参数和工作距离c线表示盖玻璃的上表面，10个物镜的动作距离为7.63mm，40个物镜的动作距离为0.198mm，10/0.25、40/0.65、100/1.25表示透镜的倍率和数字数值孔径。 160/0.17表示显微镜的机械镜筒长度(从标本到目镜的距离)和玻璃罩的厚度。 即，镜筒长度为160mm，盖玻璃的厚度为0.17mm。工作距离因物镜而异。 工作距离是指在显微镜运动的状态下(对焦、物体像清晰)，物镜的最下端与盖板玻璃上表面之间的距离。 物镜的放大率与其工作距离成反比。 在将后视镜调整为工作距离后，可以直接切换后视镜和油镜，用细的调整螺钉稍微调整焦距就能看到清晰的物体像，这叫做同一高焦点。虽然不同放大率的物镜也可从外形上区分出来，但通常物镜的长度与放大率成比例，低放大率透镜最短，油透镜最长，高放大率透镜的长度介于两者之间。3、聚光器：位于载物台的通光孔之下，由聚光镜和光圈构成，其主要功能是将光集中在所观察的标本上。 聚光镜由23个透镜组合而成，其作用相当于一个凸透镜，可以将光线汇聚成束。 聚光器左下方有调节螺旋可以调节光的强弱，提升聚光器可以使光变强，反之光变弱。光圈也称为彩虹光圈或孔径光圈，位于聚光器的下端，是能够控制进入聚光器的光束大小的可变光圈。 它由十几块金属薄板组合而成，其外侧有一个小花纹，可以通过增大或减小光圈的口径来调节光的强弱。 光圈下面有滤镜框，可以放置不同颜色的滤镜。4、反射镜：位于聚光镜下方，可向各个方向转动，可将来自不同方向的光反射到聚光器上。 反射镜有两个面，一个面是平面镜，另一个面是凹面镜，凹面镜具有聚光作用，适用于弱光和散射光。 光线强时选择平面镜(现在一些新型光学显微镜都有光源，但没有反射镜)。 也有同时配置的)。二、光学显微镜的使用方法(-)准备小心地将显微镜从镜箱中取出(移动显微镜时用右手拿着镜壁，用左手拿着镜座)，放在实验台的左侧，镜座的后端最好离实验台的边缘约610cm。 首先检查显微镜的各部件是否完整正常。 如果是镜筒纵型光镜，则能够使镜筒倾斜一定角度(一般不能超过45度)而容易观察(在观察临时安装片时，不能倾斜镜筒的臂)。(2)低倍镜的使用方法1、对光：打开实验台的作业灯(有光源显微镜的情况下，应该打开显微镜的电源开关)，旋转粗调螺钉将镜筒稍微抬起(或者降低载物台)，调节物镜变换器，使低倍镜处于动作状态(即与光通过孔对应)，透镜完全设置时很轻打开光圈，使聚光器上升到适当的位置(聚光透镜上端的透镜平面最好是比平台平面稍低的高度)。 然后，用左眼朝向目镜内进行观察(注意同时打开双眼)，同时调节反射镜的方向(拿着光源显微镜，带着调节亮度的把手)，使视场内的光均匀且明亮度适度。2、放置玻璃标本：将玻璃标本放置在载物台上，用标本移动器的弹簧夹固定(注意：有玻璃盖或标本的面朝上)，旋转标本移动器的螺旋，使待观察的标本部位对准透光孔的中央。3、调节焦距：用眼睛从侧面注视低倍镜，同时用粗调螺旋降低透镜(或抬起平台)，直到低倍镜距玻璃标本的距离小于0.6cm为止(操作时注意不要让透镜碰到玻璃板时，必须从侧面注视透镜和玻璃板的距离) 然后，一边用左眼用目镜观察，一边用左手慢慢地转动粗调螺旋，使镜筒上升(或者使载物台下降)，旋转微调螺旋直到视野中出现物像，使视野中物像看起来最清晰。当要观察的物体像不在视野的中央、不在视野内时，可以用标本移动器将标本的位置前后、左右移动，将物体像进入视野并移动到中央。 对焦时镜头与玻璃标本之间的距离超过1cm仍未看到物体像时，请按照上述步骤重新操作。(3)高倍镜的使用方法1 .在用高倍镜观察标本之前，先搜索要用低倍镜观察的物体像，移动到视野的中央，调整焦距，使观察的物体像最清晰。2 .旋转物镜转换器，直接使高倍率反射镜处于工作状态(对应光通过孔)时，视野中可以看到不清楚的物体像，只需调节细聚焦螺旋，一般就能清楚地看到物体像。注意：(1)在从低倍透镜的聚焦状态直接切换为高倍透镜的情况下，高倍物镜有时会碰到玻璃板而无法切换到规定位置(这种情况下，主要是高倍透镜、低倍透镜未设置，即不是同一机种的显微镜上的透镜)，在这种情况下，无法进行硬的旋转检查玻璃板是否翘曲、低倍透镜的焦距是否调整、物镜是否松动等，重新操作。 在即使调整也无法进行变换的情况下，提升镜筒(或降低镜台)后进行变换，在眼睛的注视下将高倍透镜接近盖玻璃，在观察目视视野的同时，以粗调螺旋慢慢提升透镜(或降低镜台)，看到物体像后再以微调螺旋对焦。(2)由于制造工艺上的原因，许多显微镜的低倍镜视野中心与高倍镜视野中心存在一定的偏差(即低倍镜与高倍镜的光轴不在一条直线上)，因此从低倍镜切换高倍镜来观察标本总是难以使观察者迅速地找到标本。 为了避免这种情况，为了帮助观察者在高倍镜下快速发现所需的放大部分的物像，可以测定羊毛交叉片标本所使用的光镜的偏心，并制作偏心图。 具体操作步骤如下：高倍镜下找到羊毛交叉点并移动到视野中心更换低倍镜观察羊毛交叉点是否仍在视野中央，偏离视野中央时，重复几次该位置为偏心位置前面的两个步骤，找到正确的偏心位置，绘制偏心图。 发现光镜的偏心点后，使用该显微镜的高倍镜观察样本时，在低倍镜下将想要进一步放大的部位移动到偏心位置，切换高倍镜观察时，需要的观察对象正好位于视野的中央。(4)油镜的使用方法1 .用高倍镜找到想要观察的标本像，将想要进一步放大的部分移动到视野中央。2 .将聚光器提升到最高位置，使光圈达到最大(因为油镜所需的光线很强)。3 .旋转物镜切换盘，取下高倍镜，向玻璃标本上应该观察的部位(相当于载玻片的正面、通光孔的位置)滴下沥青(折射率1.51 )或蜡油(折射率1.47 )作为介质，在眼睛的注视下使油镜处于工作状态。 此时，油镜下端的镜面应该正好浸泡在油滴中。4、左眼一边注视目镜，一边小心地慢慢旋转微调螺钉(注意：这种情况下只能使用微调螺钉，绝对不能使用粗调螺钉)，使透镜稍微上升直到视野中出现清晰的物体像(或者使载物台下降)。 操作时请勿向相反方向旋转细小的调节螺钉，以免镜头下降导致标本损坏或镜头损坏。用完油镜后，必须把镜头上的油擦干净。 作业时，首先使油镜上升1cm，将其离开通光孔，首先用干透镜纸擦拭，去除大部分油，用沾了少量洗涤剂和二甲苯的透镜纸擦拭，最后用干透镜纸擦拭。 关于玻璃板标本上的油，如果是带盖玻璃的永久性电影，请用上述方法直接擦拭。如果是没有盖玻璃的标本，盖玻璃上的油用拉纸法擦拭，一张张的镜纸盖上油滴，然后往纸上滴几滴洗涤剂或二甲苯。 潮湿的时候把纸往外拉，重复多次就会变得干净。三、显微镜应注意的事项1、取显微镜时，请用一只手握住镜头臂，用一只手支撑镜头座，用一只手拿着，以免目镜和其他部件掉落。2、镜子为立式显微镜时，镜筒的倾斜角度不得超过4