【实验】培养基的配制和灭菌.ppt

到目前为止几十项诺贝尔生理学和医学奖、化学奖都与微生物学有关,微生物基础知识,微生物的分类,原核生物,原生生物,真菌,病毒,特点：,结构都相当简单,个体多数十分微小。通常要用光学显微镜或电子显微镜才能看清楚。,专题2:微生物的培养与应用,课题1微生物的实验室培养,一、培养基作用、种类二、无菌技术三、制备牛肉膏蛋白胨培养基四、纯化大肠杆菌,主要内容,一、培养基,人们按照微生物对营养物质的不同需求，配置出供其生长繁殖的营养基质称培养基。,1.培养基定义：,2.培养基的营养构成,(1)基本成分：,碳源、氮源、水、无机盐,碳源,无机碳源：,有机碳源：,CO2、CO32-、HCO3-,牛肉膏、蛋白胨等,自养微生物,异养微生物,氮源,无机氮源：,有机氮源：,NH4、NO3-,牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等,注：含C、H、O、N的有机物是异养型微生物的碳源、氮源,牛肉膏又称牛肉浸膏，是采用新鲜牛肉经过剔除脂肪、消化、过滤、浓缩而得到的一种棕黄色至棕褐色的膏状物。有牛肉自然香味，易溶于水，水溶液呈淡黄色。富含：糖类、碳源、维生素、磷酸盐等蛋白胨蛋白胨是将肉、酪素或明胶用酸或蛋白酶水解后干燥而成的外观呈淡黄色的粉剂，具有肉香的特殊气息。蛋白质经酸、碱或蛋白酶分解后也可形成蛋白胨。在胃内蛋白质的初步消化产物之一就是蛋白胨。蛋白胨富含有机氮化合物，也含有一些维生素和糖类。富含：氮源、一些维生素,(2)特殊营养：,（牛肉膏、酵母膏、蛋白胨中含有）,(3)pH、氧气的需求,维生素、碱基等,例如:培养乳酸杆菌时需要在培养基中添加维生素；培养霉菌时需将PH调至酸性；培养细菌时需将PH调至中性或微碱性；培养厌氧型微生物时则需要提供无氧的条件。,培养基的成分及功能,据化学成分可分为：_培养基和_培养基据外观物理状态可分为：_培养基_培养基和_培养基据培养基功能可分为：_培养基和_培养基和基础培养基,天然,合成,液体,半固体,固体,鉴别,培养基的类型,选择,3.培养基的类型和用途,比较：固体培养基和半固体培养基、液体培养基。,区别：加入琼脂的量决定培养基的形态。熔点：96凝固点：40注意：一般细菌不能利用琼脂。,菌落,选择培养基用途：从众多微生物中选择、分离出所需要的微生物原理：依据某些微生物对某些物质的抗性而设计制备方法：在培养基中加入某种化学物质,以抑制不需要的微生物的生长,促进所需要的微生物的生长。,常见选择培养基举例：,加入青霉素的培养基:不加氮源的无氮培养基:不加含碳有机物的无碳培养基:唯一碳源为纤维素的培养基：,分离酵母菌、霉菌等真菌,分离固氮菌,分离自养型微生物,分解纤维素的细菌,鉴别培养基用途：鉴别不同种类的微生物原理：依据微生物产生的某些代谢产物与培养基中特定试剂或化学药品反应，产生明显的特征变化而设计制备方法：在培养基中加入某种指示剂或化学药品,用以鉴别不同种类的微生物。,鉴定培养基举例：,大肠杆菌在伊红美蓝培养基上典型特征,大肠杆菌菌落呈黑色中心,有金属光泽,4.培养基配制原则：,（1）目的要明确：要根据所培养的微生物的种类、培养的目的等，选择原料配制培养基。（2）营养要协调：注意各种营养物质的浓度和比例。（碳源和氮源的比最为重要）如：谷氨酸生产中C:N=4:1菌体大量繁殖而产生的谷氨酸少。C:N=3:1菌体繁殖受抑制但谷氨酸的合成量大增。（3）pH要适宜：各种微生物适宜生长的pH范围不同。细菌pH为：6.5-7.5；放线菌pH为：7.5-8.5；真菌pH为：5.0-6.0。,二、无菌技术,1、获得纯净培养物的关键：,防止外来杂菌的入侵,2、无菌技术包括：,（1）对实验操作空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒；,（2）将培养器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌；,（3）为避免周围微生物污染，实验操作应在酒精灯火焰附近旁进行；,（4）避免已灭菌处理的材料用具与周围物品相接触。,（1）消毒定义：指使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物。（不包括芽孢和孢子）对象：操作空间、双手,3.消毒与灭菌的概念,使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子，而达到完全无菌之过程。对象：接种环、接种针、玻璃器皿、培养基等,（2）灭菌的定义：,(1)常用的消毒方法：,4.常用的消毒与灭菌的方法,煮沸消毒法:在100煮沸5-6min可以杀死微生物细胞和一部分芽孢。,巴氏消毒法：在70-75煮30min或80煮15min可以杀死不耐高温的液体中的微生物，并且使液体中的营养成分不被破坏。（如牛奶）,化学药剂消毒法:用70%的酒精擦拭进行皮肤消毒;用氯气消毒水源等。,紫外线消毒,灼烧灭菌：接种用具和接种过程中的试管口或瓶口放在酒精灯火焰的充分燃烧层中进行灼烧灭菌。,(2)常用的灭菌方法：,干热灭菌：将玻璃器皿、金属用具等能耐高温并需要保持干燥的物品放到干热灭菌箱内，在160170OC中加热12h即可。,(2)常用的灭菌方法：,高压蒸汽灭菌：将需灭菌的物品放到盛有水的高压灭菌锅内煮沸，待冷空气排尽后，密闭继续加热至锅内压力到100kPa，温度到121OC后，维持1530min即可。,(2)常用的灭菌方法：,1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？,2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。（1）培养细菌用的培养基与培养皿（2）玻棒、试管、烧瓶和吸管（3）实验操作者的双手,答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。,答：（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒。,旁栏思考,（一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基,1.计算：,2.称量准确称取各种成分，注意事项：牛肉膏要放在称量纸上称量，牛肉膏、蛋白胨都易吸潮，称取时动作要迅速，称后及时盖上瓶盖。,三、实验操作,3.溶化：先将牛肉膏连同称量纸一起放入烧杯，加少量水，加热至牛肉膏溶化并与称量纸分离后，用玻璃棒取出称量纸。加入蛋白胨和氯化钠，用玻璃棒搅拌使之溶解，再加入琼脂，搅拌，待溶解后，加自来水定溶至100mL。,4.灭菌：将配制好的培养基放到锥形瓶中,瓶口加棉塞，包上牛皮纸，并用皮筋勒紧再放到高压锅内灭菌；将培养皿放入干热灭菌箱内灭菌,5.倒平板：待培养基冷却到50OC左右时倒平板。,倒平板操作,倒平板操作的讨论:,1.培养基灭菌后要冷却到50OC时倒平板。用什么办法来估计培养基的温度？用手触摸锥形瓶，温度下降到刚刚不烫手时即可开始倒平板。,2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。,3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。,4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。,（二）纯化大肠杆菌,微生物接种常见方法：平板划线法和稀释涂布平板法,1.平板划线法通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体称菌落。,菌落,1.定义：单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落。2.特征：大小、形状、光泽度、颜色、透明度等。3.功能：菌落是鉴定菌种的重要依据。,菌落,细菌的菌落特征因种而异,菌落,细菌的菌落特征因种而异,1、为什么在操作的第一步以及划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环？,第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后仍然要灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。,平板划线法的讨论:,2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？以免接种环温度太高，杀死菌种。3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。,平板划线法获取的微生物经恒温培养后的生长情况,平板划线法获取的微生物经恒温培养后的生长情况,2.稀释涂布平板法将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。稀释涂布平板法操作过程分两个步骤，即系列稀释操作和涂布平板操作。,系列稀释操作,101,102,103,104,105,106,(1)将分别盛有9mL水的试管灭菌并编号。,(2)用移液管吸取1mL培养的菌液，注入第二支试管中，轻压橡皮头，吹吸三次使之充分混匀。,(3)从101倍稀释的试管中吸取1mL稀释液，注入第三支试管中，重复步骤2，直至到第六支试管。,涂布平板操作,(1)将涂布器浸在盛有70的酒精的烧杯中。,(2)取少量菌液（不超0.1mL），滴加到培养基表面。,(3)将沾有酒精的涂布器在火焰上引燃，火熄后冷却810s。,(4)用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。,稀释涂布平板法获取的菌落,涂布平板操作讨论:,涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何进行无菌操作？应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围等等。,将接种后和未接种（作为对照组）的培养基均放到370C的恒温箱中，培养1224h后进行观察并记录结果。,1.未接种的培养基表面是否有菌落生长？如果有菌落生长，说明了什么？未接种的培养基在恒温箱中保温12d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。,2.在接种大肠杆菌的培养基上，能否观察到独立的菌落？它们的大小、形状、颜色相似吗？如果接种成功的话，在培养基的表面可观察到大小、形状、颜色相似的菌落。,四、结果分析与评价,3.培养12h和24h后，观察到的实验结果相同吗？如果不同，请分析产生差异的原因？培养12h与24h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同。随着时间的延长、菌落的不断生长，使菌落不断增大。,4.如果在培养基上观察到不同形态的菌落，请分析其可能的原因。无菌操作未达到要求：可能是培养基灭菌不彻底；可能是接种时发生了污染；也可能是在培养的过程中受到了污染。,1.临时保藏将菌种接种到试管的固体斜面培养基上，培养成菌落后，置于4OC的冰箱中保存（每隔36个月要重新接种培养后再保存）。,2.甘油管藏在3mL的甘油瓶中加入1mL的甘油，高压灭菌。将1mL培养的菌液转移到甘油瓶中，充分混合后，置于20OC的冷冻箱中保存。,五、课题延伸-菌种的保藏,课堂小结,课堂练习,例1关微生物营养物质的叙述中，正确的是A.是碳源的物质不可能同时是氮源B.凡碳源都提供能量C.除水以外的无机物只提供无机盐D.无机氮源也能提供能量,解析：不同的微生物，所需营养物质有较大差别，要针对微生物的具体情况分析。对于A、B选项，它的表达是不完整的。有的碳源只能是碳源，如二氧化碳；有的碳源可同时是氮源，如NH4HCO3；有的碳源同时是能源，如葡萄糖；有的碳源同时是氮源，也是能源，如蛋白胨。对于C选项，除水以外的无机物种类繁多，功能也多样。如二氧化碳，可作为自养型微生物的碳源；NaHCO3，可作为自养型微生物的碳源和无机盐；而NaCl则只能提供无机盐。对于D选项，无机氮源提供能量的情况还是存在的，如NH3可为硝化细菌提供能量和氮源。,D,例2下面对发酵工程中灭菌的理解不正确的是A.防止杂菌污染B.就是指消灭杂菌C.培养基和发酵设备都必须灭菌D.灭菌必须在接种前,解析：灭菌是微生物发酵过程的一个重要环节。A说的是灭菌的目的，因为发酵所用的菌种大多是单一的纯种，整个发酵过程不能混入其他微生物（杂菌），所以是正确的；B是错误的，因为灭菌的目的是防止杂菌污染，但实际操作中不可能只消灭杂菌，而是消灭全部微生物，包括芽孢和孢子；C是正确的，因为与发酵有关的所有设备和物质都要灭菌；发酵所用的微生物是灭菌后专门接种的