放免与单克隆抗体

放射免疫分析法Radioimmunoassay，RIA,美国女免疫学家罗莎琳雅洛（RosalynS.Yalow），因创立了放射免疫法而荣获1977年诺贝尔生理学及医学奖。,放射免疫分析法是利用同位素标记的与未标记的抗原，同抗体发生竞争性抑制反应的方法，研究机体对抗原物质反应的发生、发展和转化规律。,雅洛1921年出生于纽约，1945年获得核物理学博士学位，1975年当选美国科学院院士。因为发明了放射性免疫分析法，雅洛获得1976年的拉斯克基础医学奖，成为历史上第一位获得该奖的女性科学家。次年，她因为与她的合作者贝尔森博士合作开发了“针对多肽类激素的放射性免疫分析法”，而成为诺贝尔生理学或医学奖史上第二位女性获奖者。放射免疫分析法（又称放射免疫测定或放射免疫测定法，简称放免或放免法）,原理放射性同位素标记的抗原（简称“标记抗原”Ag*）和非标记抗原（标准抗原或待测抗原Ag）同时与数量有限的特异性抗体Ab之间发生竞争性结合（抗原抗体反应）。Ag*与Ag的免疫活性完全相同，对特异性Ab具有同样的亲和力。,当Ag*和Ab为数量恒定时，Ag和Ag*的总量大于Ab上的有效结合点时，Ag*-Ab复合物的形成将随着Ag量的增加而减少，而非结合的或游离的Ag*则随着Ag数量的增加而增加（也就是所谓的竞争结合反应），,*Ag-Ab与Ag的含量呈一定的函数关系。因此测定Ag*-Ab或Ag*即可推出Ag的数量。,采用一种有效的分离方法，将*Ag-Ab和Ag-Ab复合物(以B表示)与*Ag、Ag(以F表示)分离,并测定B和F的放射性,可有以下规律:如样品中Ag增多，则B的放射性降低，F的放射性增高，即Ag与B成反比。计算B/F或B/T值(T=B+F),即可从标准曲线上查出样品中Ag的含量。,抗体：应用免疫技术可以获得特异性的抗体。抗体的敏感度范围由其特异性和亲和力决定，测定时所用的抗体稀释度越低，则加入的量越多，测定的敏感度越低，可测范围越宽。如加入抗体量少，则测定的敏感度提高，可测范围变窄。一般在选定标记抗原用量后，即可根据测定要求来选择合适的抗血清用量。,放射性同位素：有3H、125I、131I等，3H可以置换有机化合物中的氢，且不影响原有化学性质。*3H半衰期长，能量低，便于防护，常用的标记化合物有3H环磷酸鸟苷、3H环磷酸腺苷、3H睾丸酮等。*125I和131I原子的化学性质比较活泼,标记方法简便,不论多肽、蛋白质或小分子半抗原均可进行碘标记。*有些半抗原不能直接用碘标记,常常接上一个酪氨酸再以碘标记,以减少标记抗原免疫化学活性的损失。常用的偶联试剂：碳化二亚胺类、烷基氯甲酸酯类、二异氰酸盐类及亚氨酸酯等。,RIA法的特点优点：灵敏、特异、简便易行、用样量少等，常可测至皮摩尔。本法虽然也用放射性物质，但一般都是在测试样品时再加入标记的同位素示踪物，此示踪物的放射性强度极低，一般不会引起辐射损伤。缺点：有时会出现交叉反应、假阳性反应，组织样品处理不够迅速，不能灭活降解酶和盐及pH有时会影响结果等。,应用领域放射免疫分析法包括两个方面的技术：第一是生物学方面的。它利用特殊抗体的反应，甄别所给定的有机物质；第二是物理学方面的。它将有放射性的原子引入有机物质中，给这些有机物质打上记号。放射免疫分析法，是一种灵敏度高、较简便的测量法，几乎可测定生物体内任何物质，包括生物体本身分泌的各种激素，病人口服或注射的各种药物，一些病毒抗原等，已广泛用于临床常规检验。,内分泌学中测定胰岛素、催乳素、黄体化激素、促卵泡成熟激素、前列腺素等，以研究激素的生理和药理作用，目前较多用于研究激素与受体结合的机理。传染病学方面广泛用于乙型肝炎抗原的亚型分类测定。临床免疫学上测定免疫球蛋白G、免疫球蛋白E及抗脱氧核糖核酸抗体;进一步的应用包括甲状腺球蛋白抗体、类风湿因子、补体及抗食物抗原抗体的测定。肿瘤学方面用于测定癌胚抗原、血纤维蛋白溶酶原、叶酸、维生素B12以及血纤维蛋白原和血纤维蛋白降解产物。根据已建立的人绒毛膜促性腺激素、癌胚抗原和甲胎蛋白的RIA结果,为有效地初筛和在手术后追踪释放这些蛋白质的肿瘤提供了参考依据。在药理学方面可测定吗啡、氯丙嗪、苯妥英钠、庆大霉素、地高辛、茶碱等，是检测药物中毒和药物代谢的一个比较迅速和简便的方法。,展望,在本法的基础上，近年来又发展了其他免疫分析法，用其他有特殊性质的物质代替放射性同位素来标记抗原，同样利用标记与未标记抗原与抗体的竞争性结合，然后用适宜方法测定。其中研究较多的是荧光免疫分析，采用荧光化合物标记抗原，结合分离后通过荧光值的测定进行定量分析。,单克隆抗体monoclonalantibody（McAb),1975年英国科学家Kohler和Milstein将产生抗体的淋巴细胞同肿瘤细胞融合,成功的建立了单克隆抗体技术，1984年获得诺贝尔医学和生理学奖。,一，原理,每个B细胞仅识别一种抗原表位，肿瘤细胞在体外培养条件下可无限传代。二，方法Kohler和Milstein设计了如下方法：,杂交瘤技术1，动物免疫用特定的外来抗原对动物进行一次或多次免疫,以刺激其能分泌对于该抗原的B淋巴细胞大量增殖,从而得到大量产生专一反应的B淋巴细胞。2，细胞融合B淋巴细胞在体外存活时间很短，骨髓瘤细胞不分泌任何免疫球蛋白,却能在体外长期存活。将这两种细胞的特性结合，得到既能分泌抗体又能在体外长期存活的细胞。杂交过程中会产生混合物,需要筛选出其中唯一有用的杂交瘤细胞3，杂交瘤细胞的筛选用HAT培养基,mAb的优点：结构单一纯度高特异性强制备成本低,应用,*健康诊断试纸1早孕