叶绿素荧光参数及意义

第一节第一节 叶绿素荧光参数及其意义叶绿素荧光参数及其意义 韩志国，吕中贤（泽泉开放实验室，上海泽泉科技有限公司，上海，200333） 叶绿素荧光技术作为光合作用的经典测量方法，已经成为藻类生理生态研究领域功能最强大、使用最 广泛的技术之一。由于常温常压下叶绿素荧光主要来源于光系统 II 的叶绿素 a，而光系统 II 处于整个光合 作用过程的最上游，因此包括光反应和暗反应在内的多数光合过程的变化都会反馈给光系统 II，进而引起 叶绿素 a 荧光的变化，也就是说几乎所有光合作用过程的变化都可通过叶绿素荧光反映出来。与其它测量 方法相比，叶绿素荧光技术还具有不需破碎细胞、简便、快捷、可靠等特性，因此在国际上得到了广泛的 应用。 1 叶绿素荧光的来源叶绿素荧光的来源 藻细胞内的叶绿素分子既可以直接捕获光能，也可以间接获取其它捕光色素（如类胡萝卜素）传递来 的能量。叶绿素分子得到能量后，会从基态（低能态）跃迁到激发态（高能态） 。根据吸收的能量多少， 叶绿素分子可以跃迁到不同能级的激发态。若叶绿素分子吸收蓝光，则跃迁到较高激发态；若叶绿素分析 吸收红光，则跃迁到最低激发态。处于较高激发态的叶绿素分子很不稳定，会在几百飞秒（fs，1 fs=10 15 s）内通过振动弛豫向周围环境辐射热量，回到最低激发态（图 1） 。而最低激发态的叶绿素分子可以稳定 存在几纳秒（ns，1 ns=10 9 s） 。 波长 吸收 荧光 红 B 蓝 荧光 热耗散 最低激发态 较高激发态 基态 吸收蓝光 吸收红光 能量 A 图 1 叶绿素吸收光能后能级变化（A）和对应的吸收光谱（B） （引自韩博平 et al., 2003） 处于最低激发态的叶绿素分子可以通过几种途径（图 2）释放能量回到基态(韩博平 et al., 2003; Schreiber, 2004)：1）将能量在一系列叶绿素分子之间传递，最后传递给反应中心叶绿素 a，用于进行光化 学反应；2）以热的形式将能量耗散掉，即非辐射能量耗散（热耗散） ；3）放出荧光。这三个途径相互竞 争、此消彼长，往往是具有最大速率的途径处于支配地位。一般而言，叶绿素荧光发生在纳秒级，而光化 学反应发射在皮秒级（ps，1 ps=10 12 s） ，因此在正常生理状态下（室温下） ，捕光色素吸收的能量主要用 于进行光化学反应，荧光只占约 3%5%(Krause and Weis, 1991; 林世青 et al., 1992)。 在活体细胞内，由于激发能从叶绿素 b 到叶绿素 a 的传递几乎达到 100的效率，因此基本检测不到 叶绿素 b 荧光。在常温常压下，光系统 I 的叶绿素 a 发出的荧光很弱，基本可以忽略不计，对光系统 I 叶 绿素 a 荧光的研究要在 77 K 的低温下进行。因此，当我们谈到活体叶绿素荧光时，其实指的是来自光系 统 II 的叶绿素 a 发出的荧光。 图 2 激发能的三种去激途径（引自韩博平 et al., 2003） LHC，捕光色素蛋白复合体。 2 叶绿素荧光的研究历史叶绿素荧光的研究历史 在 19 世纪就有了关于叶绿素荧光现象的记载。最初是在 1834 年由欧洲传教士 Brewster 发现，当强光 穿过月桂叶子的乙醇提取液时，溶液的颜色由绿色变成了红色。1852 年 Stokes 认识到这是一种光发射现 象，并创造了“fluorescence”一词。 1931 年， 德国科学家 Kautsky 和 Hirsch 用肉眼观察并记录了叶绿素荧光诱导现象， 明确指出暗适应处 理的叶片照光后的诱导过程中， 叶绿素荧光强度的变化与 CO2固定呈相反的关系(Kautsky and Hirsch, 1931; Govindjee, 1995)，此后的 10 余年中，Kautsky 和他的学生 Franck 就这一现象作了系统的研究(Kautsky and Franck, 1943)。在 Kautsky 研究的基础上，后人进一步对叶绿素荧光诱导现象进行了广泛而深入的研究， 并逐步形成了光合作用荧光诱导理论，被广泛应用于光合作用研究。由于 Kautsky 的杰出贡献，叶绿素荧 光诱导现象也被称为 Kautsky 效应（Kautsky Effect） 。 从 1960 年代到 1980 年代早期，叶绿素荧光这一生物物理学的技术被广泛用于光合作用基础研究，很 多重要发现都与这一技术有关，如光合作用存在两个光反应的提出(Duysens and Sweers, 1963)就是采用的 这一技术应用的典型代表。但在那个年代，所有的叶绿素荧光测量都只能在完全遮蔽环境光的“黑匣子” 里进行，这大大限制了叶绿素荧光技术在植物胁迫生理学、生理生态学和植物病理学等领域的应用。因此 在很长一段时间中，叶绿素荧光技术在基础研究和应用研究的使用中存在一个鸿沟。尽管如此，情况还是 在逐步好转。这是因为虽然叶绿素荧光信号虽然复杂，但确实提供了可靠的、定量的信息，并且可以由越 来越小型化的仪器来进行测量。 1980 年代中期，德国乌兹堡大学的 Schreiber 提出了叶绿素荧光测量的饱和脉冲理论，并发明了脉冲- 振幅-调制（Pulse-Amplitude-Modulation）叶绿素荧光仪(Schreiber, 1986; Schreiber et al., 1986)，也就是今天 大名鼎鼎的调制叶绿素荧光仪 PAM。Schreiber 早年师从 Kautsky 的学生 Franck，在后者的指导下很早就开 始进行叶绿素荧光研究(Schreiber et al., 1971; Gielen et al., 2007)，并在 1975 年就设计出了科研界第一款便 携式叶绿素荧光仪(Schreiber et al., 1975)。但受限于光电技术的发展，当时这款荧光仪只能测量叶绿素荧光 诱导曲线，不能进行深入的淬灭分析，直到 PAM 的出现才解决了这个问题。 调制叶绿素荧光仪 PAM 和调制叶绿素荧光测量技术在叶绿素荧光的研究历史上具有里程碑意义。它 采用了调制技术进行测量， 从而可以在有环境光照 （甚至是很强的太阳光） 的情况下记录叶绿素荧光信号； 它采用了饱和脉冲技术，使得光化学淬灭和非光化学淬灭的测量成为可能。PAM 面世后，很快就替代了传 统的光合放氧和 CO2同化技术，成为使用最广泛的光合活性测量技术。 早期的调制叶绿素荧光仪主要在实验室内进行测量，到了 1990 年代发展到可以非常方便的在野外现 场测量。早期的仪器采用光电二极管作为检测器，只能测量叶片或细胞浓度很高的藻液，后来采用光电倍 增管后可以直接检测大洋海水的叶绿素荧光。随着技术的发展，陆续出现了叶绿素荧光成像测量技术、水 下原位叶绿素荧光测量技术、显微叶绿素荧光测量技术、无线远程叶绿素荧光测量技术和利用叶绿素对浮 游植物进行分类的技术等，这些技术均在藻类学界得到了广泛的应用。 3 调制叶绿素荧光原理调制叶绿素荧光原理 为了更好的理解调制叶绿素荧光，首先要知道“荧光强度（intensity） ”和“荧光产量（yield） ”的区 别。 “荧光强度”的高低依赖于激发光的强度和仪器的信号放大倍数，其变化可以达到几个数量级的幅度。 而“荧光产量”可以理解为固定仪器设置下的荧光强度，其变化不会超过 5-6 倍，是真正包含了光合作用 信息的参数。例如针对一个暗适应处理后的样品，照射 0.5 mol m-2 s-1的测量光后，其荧光产量是非常稳 定的。假设此时仪器的增益设置为 1，荧光强度为 300 mV；当仪器的增益设置改为 3 后，荧光强度变为 900 mV。但实际上由于激发光恒定，样品发出的荧光产量是恒定的，只是在不同的信号放大倍数下检测到 的荧光强度不同而已。 理想的荧光仪必须能在不改变样品状态的情况下（即非破坏性）进行生理活性测量，需要满足如下几 条要求(Schreiber, 1986; Schreiber et al., 1986; Schreiber, 2004)： 1） 测量光必须足够低，只激发色素的本底荧光而不引起光合作用，这样才能获得暗适应后的最 小荧光 Fo； 2） 测量光由一系列微秒级的光脉冲组成，这些短光脉冲可以不同的频率给出。在很低的频率下， 即使单个微秒级光脉冲的强度比较高，也不会引起光合作用； 3） 用反应迅速、线性范围大的光电二极管（或光电倍增管）来检测这些由微秒级测量光脉冲激 发的微秒级荧光脉冲； 4） 荧光脉冲信号首先由交流耦合放大器放大，然后进一步经选择性锁相放大器处理，只放大和 调制测量光同频率的荧光信号，可以有效屏蔽环境中本身就存在的与叶绿素荧光同波长的背 景噪音（这就好比选择调频收音机的某个频道，就可以在浩如烟海的无线电波噪音中获得选 择性接收您需要的无线电波，采用调制技术，可以在大量的环境光背景噪音中选择性测量叶 绿素 a 发出的荧光） ； 5） 当打开光化光或饱和脉冲时，可以自动提高测量光频率，以提高信号采点率，有效记录一些 比较快速的荧光动力学变化（如荧光快速上升动力学） 。 调制叶绿素荧光仪有两大核心技术，一个是上文提到的光调制技术，有了它才能使得我们在有环境光 的情况下测量叶绿素荧光；另一个就是饱和脉冲技术。 所谓饱和脉冲技术，就是提供一个瞬间的强光脉冲，来暂时打断光系统 II 电子传递过程。我们已经知 道，光合机构吸收的光能有三条去激途径：光化学反应（Photochemistry, P） 、叶绿素荧光（Fluroescence, F） 和热耗散（Dissipation, D） 。根据能量守恒原理，假设吸收的光能为常数 1，得到 1=P+F+D。叶绿素荧光产 量可以测量出来，而我们希望得出 P 和 D 两个参数。根据基本的数学原理，一个等式有两个未知数是无解 的。此时如果给出一个饱和脉冲，暂时打断光化学反应过程，则 P=0，这个等式就可以求解了。由此可知， 饱和脉冲技术的基本作用就是打断光合作用，用于求出光化学反应和热耗散分别用去了多少能量。 早期，科研人员只能通过人为加入农药敌草隆（DCMU）来阻断光系统 II 的电子传递过程，从而获得 最大荧光 Fm，而这是不可逆的。后来，Schreiber 在“光强倍增”技术(Bradbury and Baker, 1981; Quick and Horton, 1984)的基础上提出了“饱和脉冲”技术(Schreiber et al., 1986)。饱和脉冲技术的最大优点在于，它 是暂时阻断光系统 II 的电子传递过程，由于持续时间很短（一般 0.2-1.5 s） ，因此饱和脉 冲关闭后光合电 子传递会在极端的时间内恢复运转。所以说这是一种可逆的过程，正是有了饱和脉冲技术，我们才能不破 坏样品的完整性就获得其光合生理参数。 4 叶绿素荧光诱导曲线和典型参数叶绿素荧光诱导曲线和典型参数 从 Kautsky 发现叶绿素荧光诱导现象并提出其与光合作用的关系后， 80 多年来利用叶绿素荧光研究光 合作用采用的最主要技术就是荧光诱导曲线。那么什么是叶绿素荧光诱导曲线呢？测量叶绿素荧光诱导曲 线能获得哪些生物信息呢？ 所谓叶绿素荧光诱导，就是将样品在黑暗的状态下适应一段时间，然后照射光化光，观察样品的光合 机构从暗转到光下的响应过程。 为什么要暗适应呢？在光合电子传递链上有一个叫做质体醌 （PQ） 的载体， 是整个电子传递过程的限速步骤，可以通俗的称之为电子门。在光合膜上 PQ 的数量与捕光色素吸收的光 子数（微摩尔级）相比是微不足道的。因此光合作用进行时，光系统 II 释放出的电子总是有部分会累积在 电子门 PQ 处，这部分处于还原态（累积电子）的电子门就处于关闭态，或者说光系统 II 的反应中心处于 关闭态。在暗适应过程中，光系统 II 无法获得光能激发，因此不会继续释放电子，累积在 PQ 处的电子会 继续往光系统 I 传递，直到所有电子都传递完毕。当 PQ 处不再累积电子后，暗适应就足够了。 暗适应结束后，就可以照光进行荧光诱导了。那么采用什么光进行诱导呢？只要能够引起光合作用的 光也就是波长在 400-700 nm 的可见光，都可以进行荧光诱导，我们给它一个专业术语叫做光化光（Actinic Light） ，也有人翻译为作用光。在光合作用领域，400-700 nm 的光也被称为光合有效辐射（Photosynthetic Active Radiation, PAR） 。光化光可以为人工光，如来自日光灯、卤素灯或发光二极管的光，也可以为自然 光（直接或间接的太阳光） 。但为了使我们的实验具有可重复性，多数荧光诱导的测量会采用仪器提供的 恒定光强的人工光（新型仪器多以光强稳定的发光二极管为主）来诱导。只有保证测量条件一致，才能对 不同材料或不同处理的样品进行直接比较。 图 3 叶绿素荧光诱导曲线（韩志国 and 吕中贤，未发表数据） SP，饱和脉冲（Saturation Pulse） ；AL，光化光（Actinic Light） 。 Fo，最小荧光；Fm，最大荧光。 整个测量过程中调制测量光需要一直打开。 图 3 是一条典型的叶绿素荧光诱导曲线，其测量步骤如下： 1） 样品首先暗适应处理一段时间，以便累积在 PQ 处的所有电子都被传走，光系统 II 的所有反 应中心都处于开放态。 然后打开测量光 （Measuring Light, ML） ， 记录暗适应后的最小荧光 Fo。 测量光很弱 （一般小于 1 mol m-2 s-1） ， 只激发色素的本底荧光但不足以引起任何的光合作用。 2） 紧接着打开一个持续时间仅有 0.2-1.5 s 的饱和脉冲（Saturation Pulse，SP） ，测量暗适应后的 最大荧光 Fm。饱和脉冲打开后，由光系统 II 处释放的电子迅速将 PQ 全部还原（电子门全部 关闭） ，光化学反应被打断，光能全部转化为叶绿素荧光和热量，荧光迅速达到最大值 Fm。 饱和脉冲的强度非常强，高等植物一般要求达到 8000-10000 mol m-2 s-1，藻类一般大于 4000 mol m-2 s-1即可。 3） 饱和脉冲关闭后荧光迅速回到 Fo 附近，然后打开光化光（Actinic Light，AL） ，记录叶绿素荧 光从黑暗转到光照的响应过程。如上所述，光合作用进行时，总是有部分电子门处于关闭态。 这部分处于关闭态的电子门本应用于光合作用的能量就转化为了叶绿素荧光和热。饱和脉冲 关闭后，电子门迅速全部打开。此时打开光化光，光系统 II 瞬间释放出大量电子，导致许多 电子门被关闭，因此实时荧光迅速上升。此时，光合器官会迅速启动调节机制来适应这种光 照状态，光系统 I 逐渐从 PQ 处获取电子。在恒定的光化光强度下，PS II 释放的电子数是恒 定的，因此随着时间的延长，处于关闭态的电子门越来越少，荧光逐渐下降并达到稳态。此 时，处于关闭态的电子门数量达到动态平衡，也就是说光系统 II 和光系统 I 达到了动态平衡。 4） 等荧光曲线达到稳态后关闭光化光，并结束整个测量过程。有时，为了精确的获得 Fo这个参 数，会在关闭光化光的同时打开一个持续几秒的远红光（Far-red Light, FL） （图 3 中未示出） ， 以加快电子从 PQ 向光系统 I 的传递。 根据图3中的Fo和Fm， 可以计算出光系统光系统II的最大光合效率的最大光合效率Fv/Fm=(Fm-Fo)/Fm(Kitajima and Butler, 1975)，它反映了植物的潜在最大光能转换效率。这是用得最广、使用频率最高的一个参数。早在 1987 年 科研人员就已经阐明多数健康维管束植物的 Fv/Fm 值为 0.8320.004(Bjrkman and Demmig, 1987)。目前科 研界已基本达成共识， 在健康生理状态下， 绝大多数高等植物的 Fv/Fm 在 0.8-0.85 之间， 当 Fv/Fm 下降时， 代表植物受到了胁迫。因此，Fv/Fm是研究光抑制或各种环境胁迫对光合作用影响的重要指标。 对藻类而言，由于其进化程度差异大，健康生理状态下的 Fv/Fm 没有很固定的值。但笔者结合大量文 献报道和实际经验，总结出了一些基本的规律。如绿藻门的最大 Fv/Fm 一般在 0.7-0.75 之间，没有很大的 种间差异性；硅藻门和甲藻门的最大 Fv/Fm 一般在 0.65-0.7 之间，也没有很大的种间差异性。对蓝藻门和 红藻门而言，由于其捕光结构为藻胆体，而藻胆体可以在光系统 II 和光系统 I 之间滑动，造成不同的藻之 间没有可以直接比较的最大 Fv/Fm 值。 若在打开光化光进行叶绿素荧光诱导的过程中，间隔一段时间打开一个饱和脉冲，则可以将光化学反 应和热耗散计算出来。图 4 就是利用这种方法测量出的叶绿素荧光诱导曲线。 图 4 带淬灭分析的叶绿素荧光诱导曲线（韩志国 and 吕中贤，未发表数据） 打开光化光进行光合诱导时，在 PQ 处会累积电子，只有部分电子门处于开放态。如果给出一个饱和 脉冲，本来处于开放态的电子门将本该用于光合作用的能量转化为了叶绿素荧光和热，此时得到的叶绿素 荧光峰值为 Fm（图 4） ，而打开饱和脉冲之前记录的荧光值为 F。根据 Fm和 F 可以求出在当前的光照状 态下光系统光系统 II 的实际光合效率的实际光合效率 Y(II)=PSII=F/Fm=(Fm-F)/Fm(Genty et al., 1989)， 它反映了光合机构目 前的实际光能转换效率。 从图 4 中可以看出，在荧光诱导过程中，不仅 F 会逐渐达到稳态，Fm也会逐渐达到稳态。实际上， 只有 F 和 Fm都达到稳态了，也就是 Y(II)达到稳态了，才是真正的达到了稳态光合作用阶段。 如图 4 所示，在光化光照射下，只有部分电子门处于关闭态，因此实时荧光 F 比 Fm 要低，也就是说 发生了荧光淬灭（quenching） 。如上文所述，根据能量守恒定律，1=P+F+D，那么 F=1-P-D。也就是说， 叶绿素荧光产量的下降（淬灭）可以由光合作用的增加引起，也可以由热耗散的增加引起。由光合作用的 引起的荧光淬灭称之为光化学淬灭（光化学淬灭（photochemical quenching, qP 或或 qL） ，由热耗散引起的荧光淬灭称之 为非光化学淬灭（非光化学淬灭（non-photochemical quenching, qN 或或 NPQ） 。光化学淬灭反映了植物光合活性的高低； 非光化学淬灭反映了植物耗散过剩光能为热的能力，也就是光保护能力。 光照状态下打开饱和脉冲时，电子门被完全关闭，光合作用被暂时抑制，也就是说光化学淬灭被全部 抑制，但此时荧光值还是比 Fm 低（图 4） ，也就是说还存在荧光淬灭，这些剩余的荧光淬灭即为非光化学 淬灭。淬灭系数的计算公式为(Schreiber et al., 1986; van Kooten and Snel, 1990; Kramer et al., 2004)： qP=(Fm-F)/Fv=1-(F-Fo)/(Fm-Fo)； qL=(Fm-F)/(Fm-Fo)Fo/F=qPFo/F； qN=(Fv-Fv)/Fv=1-(Fm-Fo)/(Fm-Fo)； NPQ=(Fm-Fm)/Fm=Fm/Fm-1。 从公式中可以看出，qP、qL 和 qN 的计算都需要 Fo这个参数，而 Fo的测量需要打开远红光，在野 外现场测量时不太方便。 因此很多文献中采用了用 Fo 代替 Fo来计算淬灭系数(Jones et al., 1998; White and Critchley, 1999)，或者用公式 Fo=Fo/(Fv/Fm+Fo/Fm)来获得 Fo后再计算淬灭系数(Oxborough and Baker, 1997)的方法，尽管得到的参数值有轻微差异，但参数的变化趋势与利用 Fo计算时是一致的。 对光化学淬灭而言，基于光合单位“沼泽”模型建立的 qP 已经被实践证明规律性不强，自从基于“湖 泊”模型的 qL 出现后，qP 用的越来越少，而 qL 用的越来越多(Kramer et al., 2004)。对非光化学淬灭而言， qN 和 NPQ 两个参数都经常使用， 由于 NPQ 的计算不需测量 Fo， 因此越来越多的人喜欢使用它(Ralph and Gademann, 2005)。 1996 年，为了表征光系统 II 吸收的激发能的去向，Genty 等(Cailly et al., 1996; Genty et al., 1996)提出 了三个互补的量子产量参数 II=(Fm-F)/Fm、NPQ=F/Fm-F/Fm 和 NO=F/Fm，即现在通常所说的 Y(II)、 Y(NPQ)和 Y(NO)， 且 Y(II)+Y(NPQ)+Y(NO)=1。 有意思的是， 由于这三个参数是在两个学术会议上提出的， 并没有在学术期刊上正式发表文献，因此直到 2004 年一直未被引用。2004 年，Kramer 等基于光合单位的 “湖泊”模型，推演出了 qL、NPQ=1-Y(II)-1/(NPQ+1+qL(Fm/Fo-1)和 NO=1/(NPQ+1+qL(Fm/Fo-1)（即 Y(NPQ)和 Y(NO)）参数(Kramer et al., 2004)，并在当年就被 Schreiber 将这些参数添加到了 PAM 系列调制 叶绿素荧光仪的软件中。在 Kramer 等（2004）的公式中，NPQ和 NO的计算都需要 qL，也就是需要测量 Fo，这增加了两个参数的测量难度。 2008 年，Klughammer 和 Schreiber 撰文重新推导了 Genty 等提出的公式，发现 Genty 等的公式不仅适 用于“湖泊”模型，也适用于“沼泽”模型，其适用性更强，且无需测量 Fo参数，在实际应用中比 Kramer 等的公式更好用(Klughammer and Schreiber, 2008)。 那么这几个参数的生物学意义是什么呢？我们已经知道 Y(II)代表光系统 II 吸收后用于光化学反应的那部分能量，剩余的未做功的能量可以分成两个部分 Y(NO) 和 Y(NPQ)。Y(NO)代表的是被动的耗散为热量和发出荧光的能量，主要由关闭态的光系统代表的是被动的耗散为热量和发出荧光的能量，主要由关闭态的光系统 II 反应中心贡反应中心贡 献；献；Y(NPQ)代表的是通过调节性的光保护机制耗散为热的能量代表的是通过调节性的光保护机制耗散为热的能量(Klughammer and Schreiber, 2008)。在强光 下当 Y(II)接近于零时，若 Y(NPQ)较高，说明藻细胞具有较高的光保护能力；若 Y(NO)较高，说明藻细胞 失去了在过剩光下自我保护的能力。在给定的环境条件下，最理想的调节机制是通过保持尽量大的 Y(NPQ)/Y(NO)比值，来获得尽量大的 Y(II)。 需要额外指出的是， 这种方法同样适用于光系统I的P700差示吸收测量。 为此， Schreiber和Klughammer 提出了光系统 I 的三个参数(Schreiber and Klughammer, 2008)：Y(I)，光系统 I 光化学能量转换的量子产量； Y(ND)，光系统 I 由于供体侧限制引起的非光化学能量耗散的量子产量；Y(NA)，光系统 I 由于受体侧限制 引起的非光化学能量耗散的量子产量；且 Y(I)+Y(ND)+Y(NA)=1。由于这三个参数不属于叶绿素荧光测量 范畴，本文将不展开描述，但将示意图（图 5）和计算公式（表 1）放在这儿，以供读者在使用时参考。 通过调制叶绿素荧光技术测量的荧光参数，除了上文提到的光合效率和淬灭系数外，还有一个参数也 是使用非常广泛的。 它就是光系统光系统 II 的相对电子传递速率的相对电子传递速率 rETR(II)= PAR Y(II) ETR-factor(Genty et al., 1989; Schreiber et al., 1994)，其中 ETR-factor 是指光系统 II 吸收的光能占总入射 PAR 的比例。在绝大多数 已发表的文献中，均没有试图去测定 ETR-factor，只是简单地假定跟“模式叶片”相同，即有 50%的 PAR 分配到光系统 II，84%的 PAR 被光合色素吸收(Bjrkman and Demmig, 1987)。因此在已有的文献中，rETR 一般是用公式 rETR(II)= PAR Y(II) 0.84 0.5 来计算的(Schreiber, 2004)。同样的道理，光系统光系统 I 的相对的相对 电子传递速率电子传递速率 rETR(I)= PAR Y(I) 0.84 0.5。 近期，Schreiber 等利用最新研制的多激发波长调制叶绿素荧光仪 MULTI-COLOR-PAM，实现了光系光系 统统 II 的绝对电子传递速率的绝对电子传递速率 ETR(II)的测量(Schreiber et al., 2011; Schreiber et al., 2012)。首先需要利用 MULTI-COLOR-PAM 测定某个波长下的光系统 II 功能性光学截面积 Sigma(II)（单位 nm2） （其中 为波 长） （详细测量方法见第六章第五节） ，然后求出光系统 II 的量子吸收速率 PAR(II)=Sigma(II) L PAR=0.6022 Sigma(II) PAR。其中 L 为阿伏伽德罗常数，系数 0.6022 是将 1 mol quanta m-2 （即 6.022 1017 quanta m-2）转换为 0.6022 quanta nm-2，PAR(II)的单位为 quanta/(PSII s)。接下来就可以计算 ETR(II)=PAR(II) Y(II)/Y(II)max，其中 Y(II)max 是经过暗适应达到稳态后的光系统 II 的量子产量，也 就是 Fv/Fm。ETR(II)的单位为 electrons/(PSII s)。 图 5 利用饱和脉冲技术测量光系统 I 的能量转换（引自 Schreiber and Klughammer, 2008） 表 1 列出了文献中使用最广泛的一些用调制叶绿素荧光仪测量的参数，既包括主要的叶绿素荧光（光 系统 II）参数，也包括主要的 P700（光系统 I）参数，同时还列出了常用的快速光曲线拟合参数。 表 1 调制叶绿素荧光仪测量的常用调制叶绿素荧光仪测量的常用参数参数 参数参数 简写简写 计算公式计算公式 生物学意义和其它叫法生物学意义和其它叫法 参数来源文献参数来源文献 光系统 II 的最大光合效率 Fv/Fm (Fm-Fo)/Fm 光系统 II 的最大光能转换效率、最大量子产量 (Kitajima and Butler, 1975) 光系统 II 的实际光合效率 Y(II), F/Fm, PSII, II (Fm-F)/Fm 光系统 II 的实际光能转换效率、实际量子产量 (Genty et al., 1989) 光系统 I 的实际光合效率 Y(I) (Pm-P)/(Pm-Po) 光系统 I 的实际光能转换效率、实际量子产量 (Klughammer and Schreiber, 1994; Schreiber and Klughammer, 2008) 光化学淬灭 qP 1-(F-Fo)/(Fm-Fo) 光系统 II 吸收的能量用于进行光化学反应的比例， 开放态的光系统 II 反应中心所占的比例，反应了光合活性的高低 (Schreiber et al., 1986; van Kooten and Snel, 1990) qL (Fm-F)/(Fm-Fo)Fo/F (Kramer et al., 2004) 非光化学淬灭 qN 1-(Fm-Fo)/(Fm-Fo) 光系统 II 吸收的能量用于耗散为热量的比例， 也就是植物耗散过剩光 能为热量的能力，即光保护能力 (Schreiber et al., 1986; van Kooten and Snel, 1990) NPQ Fm/Fm-1 (Bilger and Bjrkman, 1990) QA的还原状态 1-qP (F-Fo)/(Fm-Fo) QA的还原状态，关闭态的光系统 II 反应中心所占的比例 (Bilger and Schreiber, 1986) 光系统 II 调节性能量耗散的量 子产量 Y(NPQ), NPQ F/Fm - F/Fm 光系统 II 吸收的激发能， 通过调节性的光保护机制耗散为热的那部分 能量 (Cailly et al., 1996; Genty et al., 1996; Klughammer and Schreiber, 2008) 1-Y(II)-1/(NPQ+1+qL(Fm/Fo-1) (Kramer et al., 2004) 光系统 II 非调节性能量耗散的 量子产量 Y(NO), NO F/Fm 光系统 II 吸收的激发能，被动的耗散为热量和发出荧光的那部分能 量，主要由关闭态的光系统 II 反应中心贡献 (Cailly et al., 1996; Genty et al., 1996; Klughammer and Schreiber, 2008) 1/(NPQ+1+qL(Fm/Fo-1) (Kramer et al., 2004) 光系统I由于供体侧限制引起的 非光化学能量耗散的量子产量 Y(ND) (P-Po)/(Pm-Po) 光系统 I 由于供体侧限制引起的非光化学能量耗散的量子产量 (Schreiber and Klughammer, 2008) 光系统I由于受体侧限制引起的 非光化学能量耗散的量子产量 Y(NA) (Pm-Pm)/(Pm-Po) 光系统 I 由于受体侧限制引起的非光化学能量耗散的量子产量 (Schreiber and Klughammer, 2008) 光系统 II 的相对电子传递速率 rETR(II), ETR(II), ETR, rETR PAR Y(II) 0.84 0.5 经过光系统 II 的相对线性电子流速率 (Genty et al., 1989; Schreiber et al., 1994) 光系统 II 的绝对电子传递速率 ETR(II) PAR(II) Y(II) / Y(II)max 经过光系统 II 的绝对线性电子流速率 (Schreiber et al., 2011; Schreiber et al., 2012) 光系统 I 的相对电子传递速率 rETR(I), ETR(I) PAR Y(I) 0.84 0.5 经过光系统 I 的相对电子流速率 (Schreiber and Klughammer, 2008) 快速光曲线的初始斜率 曲线拟合 反应了光合器官对光能的利用效率 (Ralph and Gademann, 2005) 潜在最大相对电子传递速率 rETRmax, ETRmax 曲线拟合 拟合出来的电子传递速率潜在最大值，适用于光系统 II 和光系统 I (Ralph and Gademann, 2005) 耐受强光的能力 Ik, Ek rETRmax/ Ik越高，样品对强光的耐受力越强 (Ralph and Gademann, 2005) 5 光响应曲线和快速光曲线光响应曲线和快速光曲线 光合速率随 PAR 变化的曲线就是光响应曲线（P-I 曲线，也叫 P-E 曲线） ，它不仅可以反映样品现在 的光合状态，也可以反映样品在不同环境光强下的潜在光合活性(Falkowski and Raven, 1997)。利用光合放 氧技术 （光合放氧速率） 、 调制叶绿素荧光技术 （相对电子传递速率 rETR） 、 气体交换技术（CO2固定速率） 或同位素标记技术（14C 固定速率）得到的光合速率均可用于绘制光响应曲线。由于这几种技术基于的机 理不同，得到的光响应曲线是有一定差异的。近年来，同步测量叶绿素荧光和光合放氧，同步测量叶绿素 荧光和气体交换（针对高等植物） ，以及同步测量叶绿素荧光和 P700，成为生理生态学的研究热点。利用 叶绿素荧光和其它技术结合得出的结果都表明，在光饱和前，两种技术得出的光合速率呈线性关系，达光 饱和后开始偏离线性关系，而这种偏离恰恰反映了光合器官的内在调节机制(Schreiber, 2004)。 传统的光响应曲线测量要求在某一 PAR 强度下适应一段时间（约 510 min）达稳态后测量光合速率 （利用光合放氧、气体交换或同位素标记技术时必须长时间适应才能达到检测限） ，这样反映的并非自然 光合状态，而是被仪器人工光改变过的半自然光合状态。此外，由于测量时间长，在野外测量时就无法作 平行测量。 利用调制叶绿素荧光技术，即使每个 PAR 强度下的适应时间很短（如 10-30 s） ，也可得出典型的光响 应曲线，这被称为快速光曲线（Rapid Light Curve, RLC） （图 6）(White and Critchley, 1999; Ralph and Gademann, 2005)。这项技术最初是针对海草、珊瑚等的潜水原位测量设计的(Schreiber et al., 1997; Ralph et al., 1998)，由于测量时间短、不需提前暗适应、能够反映实时光合生理状态等优点，在很短的时间内就得 到了广泛的应用(Ralph and Gademann, 2005; Serdio et al., 2005; Perkins et al., 2006; 韩志国 et al., 2006; Belshe et al., 2008)。 图 6 快速光曲线（修改自韩志国 et al., 2006） 角毛藻（Chaetoceros sp.）在 1000 molm-2s-1 强光下处理 2 h 后的快速光曲线，曲线拟合采用 Jasby 和 Platt 的方程(Jasby and Platt, 1976)。 每个测量重复三次。 图 6 为一条典型的快速光曲线，为了对其进行定量化描述，一般需要进行非线性曲线拟合。光响应曲 线技术已经存在了数十年， 科研人员设计了大量的数学模型用于对光响应曲线进行拟合分析(Jasby and Platt, 1976; Platt et al., 1980; Eilers and Peeters, 1988)， 文献中常被用来拟合快速光曲线的方程见表 2。 图 6 是采用 Jasby 和 Platt 的方程(Jasby and Platt, 1976)进行的拟合。其中为快速光曲线的初始斜率，反映了光合器官 对光能的利用效率； rETRmax是拟合出来的潜在最大相对电子传递效率； IK是初始斜率线和 rETRmax水平线 的交点在坐标横轴上的投影点，它反映了样品耐受强光的能力(Khl et al., 2005; Ralph and Gademann, 2005)。这些常用参数也列在表 1 中。 表 2 快速光曲线常用拟合方程快速光曲线常用拟合方程 方程方程 来源文献来源文献 P=PAR/(aPAR2+bPAR+c) (Eilers and Peeters, 1988) P=Pm(1-e- PAR/Pm)e-PAR/Pm (Platt et al., 1980) P=Pmtanh(PAR/Pm) (Jasby and Platt, 1976) P=PmPAR/sqrt(Pm2+(PAR)2) (Smith, 1936) 注： 公式中 P 即为 rETR， Pm 为 rETRmax。 根据 Eilers 和 Peeters 公式获取拟合参数的公式为 =1/c， rETRmax=， Ik=（公 式需重新录入） 。Platt 等（1980）公式中的代表光抑制程度。 由于快速光曲线测量时间短，测量过程对光合状态的影响小，因此基本反映了样品的自然光合状态。 此外在短时间内可以做多个样品，更加适合生态学研究，甚至被科研人员拿来用于计算初级生产力(Gilbert et al., 2000; Jakob et al., 2005)。 传统的光响应曲线测量一次大概需要 1-2 h，而快速光曲线一般近需要 1-3 min，因此可以进行很多传 统的光响应曲线不适合的科研工作。例如图 7 是用快速光曲线研究底栖硅藻光合作用的 24 h 日变化，可以 看出非常明显的日变化规律。 图 7 底栖硅藻快速光曲线的日变化（引自(Serdio et al., 2005)） 图中利用 WATER-PAM 测量了底栖硅藻 24 h 的快速光曲线变化，每隔 2 h 测量一次，每个测量重复 3 次。 图 A 和图 B 分别示出了图 C 中 a-h 共 8 个时间点的快速光曲线变化图；图 C 和图 D 分别示出了拟合参数和 ETRm（即 rETRmax）的日变化。 图 A 和图 B 中的曲线拟合采用 Platt 等的模型（Platt et al., 1980） 。 传统的调制叶绿素荧光仪一般只能提供一种或两种颜色的光源，如发出白光的卤素灯、发出蓝光的蓝 色 LED 或发出红光的红色 LED 等。 用不同颜色的光测量的结果可能会有不同， 如图 8A 所示， 用蓝光 （440 nm）和红光（625 nm）测量绿藻小球藻的快速光曲线有非常显著的差别，蓝光照射下的 rETRmax显著小于 红光照射下，且在较强的光曲线 rETR 有轻微下降趋势，这说明蓝光的更容易引发光抑制(Schreiber et al., 2011; Schreiber et al., 2012)。由此可以推测，过去文献报道的很过实验结果，可能会存在由于采用的激发光 源不同而引起的错误理解。 如上文所述，利用最新的 MULTI-COLOR-PAM，已经可以测量绝对电子传递速率 ETR(II)。如果用 ETR(II)来绘制快速光曲线会出现什么结果呢。 图 8B 是将图 8A 的结果转换成绝对电子传递速率后得到的 结果，可以看出无论是照射蓝光还是照射红光，其绝对电子传递速率是一致的。由此证明图 8A 中结果的 差异是由于不同波长下藻细胞的光系统 II 功能性光学截面积 Sigma(II)的大小不同引起的(Schreiber et al., 2011; Schreiber et al., 2012)。 这种利用绝对电子传递速率 ETR(II)绘制的快速光曲线在未来的科研中可能会 发挥越来越重要的作用。 图 8 利用相对电子传递速率（A）和绝对电子传递速率（B）分别绘制的快速光曲线（引自 Schreiber et al., 2012） 利用 MULTI-COLOR-PAM 分别以蓝光（440 nm）和红光（625 nm）作为光化光源，测量小球藻（Chlorella sp.）的快速光曲线。 图 A 中，rETR 的计算采用 0.42 作为 ETR factor。 图 B 中，蓝光和红光激发下获得的光系统 II 功能性光学截面积 Sigma(II) 分别为 4.547 和 1.669 nm2，计算绝对电子传递速率 ETR(II)440 和 ETR(II)625 的 Fv/Fm 分别为 0.68 和 0.66。 参考文献 Belshe EF, Durako MJ, Blum JE (2008) Diurnal light curves and landscape-scale variation in photosynthetic characteristics of Thalassia testudinum in Florida Bay Aquatic Botany 89: 16-22 Bilger W, Bjrkman O (1990) Role of the xanthophyll cycle in photoprotection elucidated by measurements of light-induced absorbance changes, fluorescence and photosynthesis in leaves of Hedera canariensis. 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