分光光度法最新版

.,第六章紫外-可见分光光度法(UV-visSpectrophotometry),.,内容提要,第一节分光光度法基本原理一、透光率和吸光度二、物质的吸收光谱三、Lambert-Beer定律第二节可见分光光度法第三节提高测量灵敏度和准确度的方法一、分光光度法的误差二、提高测量灵敏度和准确度的方法,.,基本要求,掌握Lambert-Berr定律以及透光率、吸光度、摩尔吸光系数等基本概念及相互关系。熟悉可见分光光度法的测定方法标准曲线法。了解物质对光的选择性吸收及吸收光谱的意义。了解提高测量灵敏度和准确度的方法。,.,第一节分光光度法基本原理,一、透光率和吸光度二、物质的吸收光谱三、Lambert-Beer定律,.,分光光度法,根据物质的吸收光谱及光的吸收定律，对物质进行定性、定量分析的一种方法。,.,分光光度法特点,灵敏度高检测限10-510-6mol.L-1适于微量组分测定准确度高相对误差25%操作简便，测定快速。显色-测定应用广泛,.,第一节分光光度法基本原理,入射光I0吸收Ia透射ItI0=Ia+It+IrI0=Ia+It,一、透光率(T)和吸光度(A),.,第一节分光光度法基本原理,透光率(transmittance)T=It/I0吸光度(absorbance),一、透光率(T)和吸光度(A),T=10-A,.,第一节分光光度法基本原理,物质对光的吸收具有选择性，只有当光子的能量(h)与被照射物质粒子的基态和激发态能量之差(E)相等时才能被吸收。M(基态)+hM*(激发态),物质对光的选择性吸收,.,WhyAbsorptionOccurs?,Energylevel:,E0,E1,E1,E1,Groundlevel,electronicExcitedlevel,molecularvibration,molecularrotation,UV/Vis,infrared,.,互补（色）光complementarycolors,第一节分光光度法基本原理,若溶液选择性地吸收了某种颜色的光，则溶液呈吸收光的互补色。,.,用不同波长的单色光依次通过某一固定浓度的有色溶液，分别测定其对不同波长的吸光度，以波长为横坐标，吸光度A为纵坐标作图，即为吸收光谱(absorptionspectrum)，或称吸收曲线。,(邻二氮菲)合铁(II)的吸收光谱,二物质的吸收光谱,max,.,峰形曲线，具有最大吸收波长max。在此波长下，溶液吸光度最大。浓度越大，吸收峰越高(A越大)。同一物质不同浓度的溶液，吸收光谱基本形状相同。最大吸收波长max位置不变。,吸收光谱的特点:,.,同一物质的同种溶液max不随物质的浓度而变。max与溶剂有关。不同物质,max不同,max是定性分析的依据（与吸光系数结合）。定量分析时，用max的单色光作入射光，灵敏度最高。,max重要参数,.,当入射光波长、强度、溶剂、吸光物质的种类和溶液温度一定时，A与液层厚度b和溶液浓度c有关：c一定,AbLambertb一定,AcBeerA=bc,三、LambertBeer定律,.,三、Lambert-Beer定律,A=bc溶液厚度b,单位:cm浓度c，单位molL-1摩尔吸光系数，单位Lmol-1cm-1若用质量浓度代替cA=ab质量浓度,单位:gL-1质量吸光系数a,单位:Lg-1cm-1,.,吸光系数,与入射光的波长、物质的性质、溶剂和温度有关；与浓度无关；103，可用于定量测定；与max一起可以作为定性的依据。,.,A=bcAab=aMT=10-bc,Lambertbeer定律,.,适用条件Preconditions:,Parallel&MonochromaticincidentlightHomogeneousmediaNoemission,scatteringorphoto-chemicalreactionslowconcentration(c0.001molL-1),.,A1=e1bc1A2=e2bc2A=A1+A2=e1bc1+e2bc2,吸光度的加合性AdditionofA,.,例：测试酶与腺苷酸(AMP)混合体系的吸光度如下A(280nm)=0.46，A(260nm)=0.58，试计算每一组分的浓度。已知：酶的(280nm)=2.96104Lmol-1cm-1(260nm)=1.52104Lmol-1cm-1AMP的(280nm)=2.4103Lmol-1cm-1(260nm)=1.5104Lmol-1cm-1吸收池厚度为1.00cm。,.,A1=e1bc1A2=e2bc2A=A1+A2=e1bc1+e2bc2A(280nm)=0.46=(280nm)bcA(260nm)=0.58=(260nm)bc,.,第三节可见分光光度法,1.标准曲线法配制系列浓度标准溶液；测定系列标准溶液吸光度A，作吸光度A对溶液浓度c的图，得过坐标原点的直线-标准曲线；在相同条件下，测量被测溶液的吸光度，在标准曲线上查得溶液浓度。,.,.,2.标准对照法先配制一个与被测溶液浓度相近的标准溶液(其浓度用cs表示)，在max处测出吸光度As，在相同条件下测出试样溶液的吸光度Ax，则试样溶液浓度cs可按下式求得：Ax/As=cx/cscx=csAx/As,.,I参比溶液的作用：扣除一切不来源于目标产物的光吸收。如：消除吸收池、溶剂、试剂、干扰物的影响。常用参比溶液：溶剂空白试剂空白试样空白,参比（空白）溶液blank,.,常用参比溶液,.,第四节,提高测量灵敏度和准确度的方法自学重点看：分光光度法的误差来源显色剂的选择测定条件的选择,.,本章小结,基本概念：吸光度，透光率，吸光系数，最大吸收波长，显色剂，参比溶液吸收曲线，标准曲线基本计算：A=bc测定方法：标准曲线法标准对照法,.,判断题,1.分光光度法灵敏度高，特别适用于常量组分的测定。（）2.光照射有色溶液时，A与T的关系为lgT=A。（）3.当某一波长的单色光照射某溶液时，若T=100%，说明该溶液对此波长的光无吸收。（）,.,4.符合Lambert-Beer定律的某有色溶液，其他条件一定，浓度越大，吸光度越大。（）5.如果吸收池的厚度增加1倍，则溶液的透光率将减少1倍。（）6.吸光系数与入射光波长、溶剂及溶液浓度有关。（）,.,7.愈大，表明溶液对入射光愈易吸收，测定的灵敏度愈高。（）8.一般值在103以上即可进行分光光度法测定。（）9.吸收曲线的基本形状与溶液浓度无关。（）,.,二、选择题,1关于Lambert-Beer定律，下述正确的是A.该定律仅适用于可见光区的单色光。B.该定律仅适用于有色物质的含量测定。C.其他条件不变，溶液浓度改变，吸光度和吸光系数都会改变。D.其他条件不变，入射光波长改变，吸光度和吸光系数都会改变。,.,2在分光光度法中吸光度A可表示为A.It/I0B.1/TC.lgTD.lg(I0/It)3下列各式哪些不符合L-B定律A.T=10bcB.1/T=10bcC.T=-lgAD.lg(1/T)=bc,.,4在可见分光光度法中，影响吸光系数的因素是（）A.入射光波长B.溶液浓度C.溶液厚度D.入射光强度,.,5下面说法正确的是A.吸收光谱的基本形状与溶液的浓度无关B.吸收光谱与物质的特性无关C.浓度愈大，吸光系数愈大D.其他因素一定时，吸光度值与测定波长成正比E.波长一定时，测定不同浓度溶液的A值可绘制吸收光谱曲线,.,6符合Beer定律的某有色物质溶液，当其浓度改变时，其吸收光谱曲线上的最大吸收峰的位置将（）A.向短波方向移动B.向长波方向移动C.不改变，但峰高度改变D.不改变，峰高度也不变E.改变，但峰高度不变,.,7分光光度法中使用试剂空白作对