胚胎干细胞的培养及其影响因素

胚胎干细胞的培养及其影响因素前言胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESC）是一种高度未分化的、具有发育多潜能性的细胞，可在体外培养扩增、遗传操作，在适当条件下可诱导分化为多种组织细胞，还可与受体胚胎发生嵌合，形成嵌合体，为细胞分化、胚胎发育、肿瘤发生、药物鉴定等方面的深入研究提供了理想的细胞模型，为组织工程、细胞移植、基因治疗等开创了取之不尽、用之不竭的细胞资源。1981年 Evans 和 Kaufman 将延迟着床的小鼠囊胚接种在经丝裂霉素 C处理的 STO（一种已建系的鼠胚成纤维细胞）上，获得了增殖而未分化的内细胞（inner cell mass,ICM ）， 后经传代克隆，第一个建立了小鼠ES细胞系1。由于小鼠的胚胎干细胞较易发生分化，昆明种属更是如此，成功分离和克隆胚胎干细胞的关键是一方面要促进其分裂增殖，一方面要最大限度抑制其分化。体外生长的细胞直接生长在培养液中，培养液是细胞分离培养中重要的因素9。胚胎干细胞对体外培养环境的要求更为严格，其很小的变化都会影响胚胎干细胞的增殖和分化。本课题研究了三种不同培养液对小鼠胚胎干细胞生长的影响，为今后胚胎干细胞建系工作提供一定参考依据。研究内容与方法1. 材料1.1 实验动物 昆明白小鼠。1.2 主要试剂：PMSG;HCG;DMEM培养液；、 无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液；杜氏磷酸盐缓冲液（PBS液）；0.25% 胰酶-ETDA混合液；丝裂酶素C（Mitomycine,Sigma）；胎牛血清（FCS，浙江生物制品厂）；新生牛血清（ NBS，天津生物制品厂）；白血病抑制因子；干细胞生长因子；牛胰岛素。22 小鼠胎儿成纤维细胞的原代培养3452.1 胚胎的获取昆明雌性小鼠选择阴道口粘膜色淡红、略湿润的性成熟母鼠，孕马血清（PMSG）16：00腹腔注射10U，48小时后腹腔注射HCG10U，即与雄鼠按1：1合笼交配。次日10：00观察母鼠阴道栓有无，阴道口见阴栓（乳白色或淡黄色蜡状物）即记为妊娠0.5 d，并做标记，同时雌雄分笼喂养。选妊娠11.5-16.5D母鼠进行胎儿成纤维细胞饲养层的制备；将妊娠3.5天孕鼠断颈处死，取出子宫，用含5%NBS的PBS液从子宫角冲出胚胎6。2.2 组织原代培养2.2.1 改良组织块法7 (1）在离心管剪碎组织中，加0. 25%胰蛋白酶-0. 02%EDTA，按 1 mL/6胎鼠加入，轻柔吹打30S。 （2）用2倍以上成纤维细胞培养液终止，室温静置5 min，弃上清液，尽量减少组织中消化酶的剩余量。 （3）再加MEF培养液（2.5 mL/胎），吹打混匀组织块。 （4）培养瓶提前用MEF培养液湿润整个瓶底，弃多余汇集的培养液。 （5）将含有组织块的悬液均匀滴入瓶底，组织悬液随即均匀平铺于培养瓶底，不会出现组织块悬浮于培养液滴中现象。 （6）后置于37 、5%CO2、100%RH培养箱中培养； （7）6小时后，将瓶底轻轻翻转平置，避免组织块脱落随培养液流动，后向组织块贴壁的背面补加液体量，继续入培养箱培养过夜； （8）第二天，轻轻翻转培养瓶，使培养液缓慢覆盖组织块，切忌动作过快，使液体产生的冲力让贴壁的组织块飘起，而造成原代培养失败。37 、5%CO2、100%RH培养箱继续培养。 （9）第三天，观察组织块贴壁及细胞游出情况，漂浮细胞多或培养液颜色变黄， （10） 将培养液及漂浮细胞全部转移至离心管中，2000rpm，8min离心去除死细胞及未贴壁组织，取上清液及新鲜培养液各一半加入培养瓶中。 2.2.2 简化酶消化法 （1）向离心管剪碎组织中，加入0.05%胰蛋白酶-0. 02%EDTA，以 2.5 mL/6胎鼠，轻柔吹打混匀组织，37水浴轻摇晃5min； （2）再加入同量的0.05%胰蛋白酶-0. 02%EDTA 轻柔吹打混匀，轻晃水浴10min； （3）超净工作台内加两倍鼠胚成纤维细胞培养液终止消化，轻吹打，最后可见絮状物将其弃之； （4）需要10cm培养皿个数=胚胎个数0.8，培养皿个数10 mL=最终接种细胞悬液量； （5）用培养液补足离心管中液体量，混匀均匀分配于培养皿中。 （6）将培养皿上下左右四个方向，呈“十”字型摇匀细胞，使细胞均匀分布于皿底，置37 、5%CO2、100%RH培养箱中培养。 （7）第二天将培养皿中全部培养液吸弃，连同漂浮死细胞，更换为新鲜成纤维细胞培养液，进行全量换液。2.3 继代MEF培养 （1）MEF80%-90%长满培养瓶底，弃全部培养液。 （2）预先37 预热的PBS清洗3遍，弃清洗液。 （3）加1ml 0. 05%胰蛋白酶-0. 02%EDTA于培养皿中，四个方向使消化液均匀流遍每个细胞表面。 （4）将培养瓶或皿置于显微镜下观察，见细胞间隙增大或大量细胞脱壁流动在消化液中时，加入两倍以上定量的培养液终止消化。 （5）弯头吸管吸取培养瓶/皿中的细胞悬液，均匀按顺序反复吹打瓶/皿各部分细胞，从瓶底部一边开始另一边结束，动作轻柔不能产生气泡，确保培养瓶细胞脱落。 （6）计数上述细胞悬液细胞数量。 （7）将上述细胞悬液一并转移入离心管中，1200rpm，5min，去除上清液。 （8）加新的培养液于离心管中，用吸管吹打使之形成均匀细胞悬液。 （9）按6104-1105个/mL 传代接种细胞。原代成纤维细胞传代时可按1：8-1：10的比例进行，以后传代可按1：2-1：3进行传代。2.4 胚胎培养 将胚胎转移至预先制备好的饲养层的6孔板或12孔板，弃全部培养液，移入前1-3小时全部换成胚胎干细胞培养液，采用3种不同的培养液，（即，培养液1：DMEM液+10%NBS+10%FCS；培养液2：1+1000IU/ml LIF；培养液3:1+10mg/ml 胰岛素），置于37、5%CO2培养箱中培养，每天观察1次，加、换液1次，记录有关胚胎贴壁、ICM出现等生长情况。2.5 内细胞团的分离 胚胎接种到有饲养层的培养板中培养45天后，弃去原培养液，加入无Ca2+、Mg2+的PBS液洗1次。在解剖镜下剥去 周围的滋胚层细胞，用吸管把 转移到干净的培养皿中。加一滴胰酶于ICM上，37，消化3min。将ICM转移到新的培养液中，用吸管吹打将其打散。把打散的细胞接种到有新鲜饲养层的培养板中，在37、5%CO2培养箱中继续培养。2 2.6 干细胞集落的分离分散的ICN细胞培养37d后，在倒置相差显微镜下观察细胞生长情况。此时形成的干细胞集落为F1代，在解剖镜下将F1代干细胞集落挑出，按照ICM分离法离散F1代干细胞集落，再获得的干细胞集落称为F2代，将F2代干细胞集落挑出，再进行分离传代数次，直至获得纯净的ES细胞集落。22.7胚胎干细胞鉴定 2.7.1 细胞形态学观察7 未分化胚胎干细胞呈克隆性生长，有明显的聚集倾向，集落呈“鸟巢”状生长，圆形或椭圆形，表面光滑，结构致密，与周围饲养层细胞分界清；集落内细胞小而圆，胞浆较亮，边界不清，排列紧密，胞核较大。 2.7.2 APK染色鉴定 将待测细胞用含7.5%蔗糖的1%多聚甲醛固定，底物buffer平衡，室温避光染色：75mg/ml NBT溶于70%DMF，50 mg/ml BCIP溶于100% DMF ，染色前分别取45l、35l 溶于10ml底物buffer中，新鲜配制。ES（PGC、EG)APK染色被染为深蓝紫色，饲养层细胞、分化细胞不着色2。 2.8 检测指标8 实验过程中，主要比较三种不同培养液中贴壁率（贴壁胚胎数/培养胚胎数）、出现率（ICM出现胚胎数培/养胚胎数）、F1出现率（出现F1胚胎数/培养胚胎数）、F2出现率（出现F2胚胎数/培养胚胎数4个与干细胞建系相关的指标。3 预期结果 与培养液1比较，培养液2、3对胚胎培养极更加有利，贴壁率、ICM出现率以及F1、F2出现率差异显著。培养液2和培养液3对胚胎贴比率、ICM出现率以及F1、F2出现率比较差异不显著。参考文献1Evans MJ et al. Nature,1981,292(5819):154-156. 2 小数胚胎干细胞培养、克隆、分离、传代研究.畜牧兽医学报，2002,33（5），433-438. 3 Sohyun L. McElroy, Renee A. Reijo Pera. Preparation of mouse embryonic fibroblast feeder cells for human embryonic stem cell culture. Cold Spring Harb Protoc, 2008:5041. 4 Sohyun L. McElroy, Renee A. Reijo Pera. Culturing Human Embryonic Stem Cells with Mouse Embryonic Fibroblast Feeder Cells. Cold Spring Harb Protoc. 2008;2008:pbd. prot5042. 5 ohyun L. McElroy, Renee A. Reijo Pera. Preparation of mouse embryonic fibroblast feeder cells for human embryonic stem cell culture. Cold Spring Harb Protoc, 2008:5041. 6 黄治军, 吕中华, 郑鹏等. 昆明小白鼠胚胎干细胞分离培养的影响因素J. 黑龙江畜牧兽医, 2010, 01:16-18. 7 李济强, 马天驰等. 小鼠囊胚在胚胎成纤维细胞饲养层上向胚胎干细胞的生长发育J. 中国组织工程研究与临床康复, 2009, 13(14):2779-2782. 8 杨奇, 史远刚, 窦忠英. 影响小鼠胎儿