生物技术制药-乙肝疫苗-制备PPT课件

乙肝疫苗的制备,组员：一班房天宇李桦楠二班李耀,辽宁何氏医学院药学系,友情提示,此文档在网页中无法完全展示，请免费下载后阅读,乙型病毒性肝炎,乙型病毒性肝炎是由乙肝病毒（HBV）引起的、以肝脏炎性病变为主，并可引起多器官损害的一种疾病。乙肝广泛流行于世界各国，主要侵犯儿童及青壮年，少数患者可转化为肝硬化或肝癌。因此，它已成为严重威胁人类健康的世界性疾病，也是我国当前流行最为广泛、危害性最严重的一种疾病。乙型病毒性肝炎无一定的流行期，一年四季均可发病，但多属散发。近年来乙肝发病率呈明显增高的趋势。乙肝疫苗的应用是预防和控制乙型肝炎的根本措施。,辽宁何氏医学院药学系,乙肝疫苗的概念,乙肝疫苗是用于预防乙肝的特殊药物。疫苗接种后，可刺激免疫系统产生保护性抗体，这种抗体存在于人的体液之中，乙肝病毒一旦出现，抗体会立即作用，将其清除，阻止感染，并不会伤害肝脏，从而使人体具有了预防乙肝的免疫力，从而达到预防乙肝感染的目的。接种乙肝疫苗是预防乙肝病毒感染的最有效方法。,辽宁何氏医学院药学系,乙肝疫苗的发展史,乙肝疫苗形成于1986年，为了得到乙肝疫苗，研究人员从研究复试病毒，到酵母，并研究纯化的蛋白质序列。并经过了大量的诱导免疫反应。1991年，疫苗被应用于高危险人群。主要是一些儿童，因为儿童的感染率极高。2005年，美国推行常规的疫苗注射。给所有未注射过乙肝疫苗的儿童注射。治疗性疫苗是指在已感染病原微生物或已患有某些疾病的机体中，通过诱导特异性的免疫应答，达到治疗或防止疾病恶化的天然、人工合成或用基因重组技术表达的产品或制品,辽宁何氏医学院药学系,疫苗的组成,疫苗的组成,抗原,免疫佐剂,辽宁何氏医学院药学系,乙肝疫苗的制备,目前使用的乙肝疫苗是基因工程疫苗-重组酵母乙肝疫苗和重组CHO乙肝疫苗，其主要成分是乙肝病毒的表面抗原，即一种乙肝病毒外衣壳蛋白，并非完整病毒。这种表面抗原不含有病毒遗传物质，不具备感染性和致病性，但保留了免疫原性，即刺激机体产生保护性抗体的能力。乙肝表面抗原曾经是从乙肝病毒携带者的血液，经纯化灭活等严格工序制备而来，即血源性疫苗，该疫苗由于安全、来源和成本等原因已被淘汰(如，有引起血源性疾病的嫌疑和浪费大量的血）,辽宁何氏医学院药学系,基因工程乙肝疫苗是采用基因工程技术生产的，即构建含有乙肝表面抗原基因的重组质粒，然后转染相应的宿主细胞，如酵母、CHO细胞，生产乙肝表面抗原蛋白。利用重组酵母生产的叫重组酵母乙肝疫苗，利用CHO细胞生产的叫重组CHO乙肝疫苗，剂量为每支5微克。它们都可以用于预防所有已知亚型的乙肝病毒感，都可以放心选用。,乙肝病毒病理切片,辽宁何氏医学院药学系,目的基因的分离,培养酵母细胞（增）,检测正确表达目的产物的酵母（检）,0.0,重组酵母构建,重组质粒的构建（切，接）,导入酵母细胞（转）,转,细胞转化手段将DNA重组分子导入酵母细胞内。,增,短时间培养转化酵母细胞，以扩DNA重组分子。,检,检,辽宁何氏医学院药学系,接,用DNA连接酶将含有外源基因的DNA片段连接到质粒分子上，构成DNA重组分子。,根据已经测定的编码乙肝病毒表面抗原决定簇基因序列，用化学合成法直接合成目的基因。用识别相同黏性末端的限制性内切酶将外源DNA和质粒分子切开。,切,筛选和鉴定经转化处理的酵母细胞，获得外源基因高效表达的基因工程菌,菌种制备和发酵,用成功构造的基因工程菌进行扩大培养，经过逐级放大至发酵罐。发酵过程应该具有下列特点：原料以碳水化合物为主，不含有毒物质，并加入少量有机和无机氮源；能容易进行大量有效的乙肝病毒表面抗原的生产；生物反应过程是以生命体的自动调节方式进行的，多个反应像一个反应一样，在单一设备中进行；生产过程中，通常常温进行，操作温和，不考虑防爆问题；能够高度选择性的进行复杂化合物在特定部分的反应，如氧化、还原、官能团导入；生产过程中考虑防止杂菌的污染。发酵过程中，可采用分批补料或连续流加补料以保证最优生长和维持细胞浓度、生长速度和营养供应之间的适当平衡。可添加诱导剂如乳糖到发酵液中去以诱导可调节启动子的表达。,辽宁何氏医学院药学系,分离纯化,细胞破碎,微滤,辽宁何氏医学院药学系,超滤,微滤,超滤,硅胶吸附,疏水层析,硫氰酸盐处理,凝胶层析,离子交换层析,无菌过滤,无菌过滤,氢氧化铝共沉淀,细胞破碎,微滤,超滤,发酵结束后，通过过滤或离心，使酵母与发酵液分离，然后细胞通过高压匀浆机破碎，释放出抗原。酵母的细胞壁较厚，比大肠杆菌难破碎，可在高压匀浆机内施加几千个大气压力，通过针形阀突然降压到零，使细胞破碎。在细胞破碎前加入蛋白酶抑制剂以防抗原被分解。,细胞破碎后加入表面活性剂使抗原溶解。粗细胞裂解物用0.2um中空纤维柱进行微滤。抗原和大部分低分子量宿主细胞内含物通过滤膜，细胞碎片被膜拦截。,滤液再进行超滤，此时抗原被膜拦截而低分子量宿主细胞内含物通过滤膜除去。,辽宁何氏医学院药学系,辽宁何氏医学院药学系,凝胶层析,离子交换层析,凝胶层析分离原理,单个凝胶珠本身象个筛子。不同类型凝胶的筛孔的大小不同。如果将这样的凝胶装入一个足够长的柱子中，作成一个凝胶柱。当含有大小不同的蛋白质样品加到凝胶柱上时，比凝胶珠平均孔径小的蛋白质就要连续不断地穿入珠子的内部，这样的小分子不但其运动路程长，而且受到来自凝胶珠内部的阻力也很大，所以越小的蛋白质，把它们从柱子上洗脱下来所花费的时间越长！凝胶中只有很少的孔径可接受大的蛋白。因此，大的蛋白质直接通过凝胶珠之间的缝隙首先被洗脱下来。凝胶过滤所用的凝胶孔径大小的选择主要取决于要纯化的蛋白质分子量。,辽宁何氏医学院药学系,凝胶层析分离原理示意图,辽宁何氏医学院药学系,辽宁何氏医学院药学系,凝胶层析,离子交换层析,离子交换层析原理,离子交换层析（IonExchangeChromatography简称为IEC）是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。离子交换层析中，基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。带有正电荷的称之阳离子交换树脂；而带有负电荷的称之阴离子树脂。由于蛋白质也有等电点，当蛋白质处于不同的pH条件下，其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质，结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。,辽宁何氏医学院药学系,离子交换层析示意图,辽宁何氏医学院药学系,无菌过滤,氢氧化铝共沉淀,分装,纯化后的抗原再与氢氧化铝共沉淀，在共沉淀时，抗原吸附在氢氧化铝上。,辽宁何氏医学院药学系,疫苗纯度的测定,乙肝疫苗是通过肌肉注射的方式进入人体系统，为了降低疫苗内杂质含量对人体产生的不良影响，必须进行疫苗的纯度检测。对重组酵母乙肝疫苗，现有的HPLC检测系统应用0.1mol/LDTT（DTT即DL-Dithiothreitol，中文名为二硫苏糖醇）与1:50吐温80等量混合处理后能有效地检测不同类型重组乙肝疫苗表面抗原的纯度。,辽宁何氏医学院药学系,DTT结构式,疫苗的保存,疫苗的稳定性较差，一般在28下能保存12个月，但当温度升高后，效力很快降低。在37下，许多疫苗只能稳定几天或者几个