药物分析抗生素.ppt

,抗生素类药物的分析,进入,返回主目录,思考与练习,第一节概述,第二节内酰胺类抗生素,第三节氨基糖苷类抗生素,第四节四环素类抗生素,第五节抗生素类药物中高分子杂质的检查,基本要求,基本要求,一、掌握抗生素类药物的结构特点与分析方法之间的关系。二、掌握抗生素类药物的鉴别原理与方法。三、掌握抗生素类药物法定含量测定方法的原理、测定方法与计算。四、熟悉抗生素类药物杂质检查的方法。五、了解抗生素类药物中高分子聚合物检查。,返回,第一节概述,1.抗生素药物的特点,化学纯度较低,活性组分易发生变异,稳定性差,2.微生物学法与理化法的比较,微生物检定法,理化法,以抗生素对微生物的杀伤或抑制程度为指标衡量抗生素的生物效价,根据抗生素结构特点，利用其特有的理化性质测定其含量,已知或新发现的抗生素、精致品或粗制品均能测定,测定化学结构已知、已提纯的抗生素,灵敏度高、样品需用量小、反映抗生素的医疗价值，但操作步骤多、费时、误差大,迅速、准确、专属性高、样品需用量小、操作简单、省时,3.抗生素的活性以效价单位来表示：,每ml或每mg中含有某种抗生素的有效成分的多少，用单位（u）或g表示。1mg青霉素G钠盐定为1667单位1mg青霉素G钾盐的单位（u）=1667356.4/372.5=1595u/mg,分类（按结构与性质）：内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类、大环内酯类、氯霉素类、多肽类、抗肿瘤类林可霉素类、其他抗生素类,返回,第二节内酰胺类抗生素,青霉素类,头孢菌素类,青霉素,（青霉素钾、钠）,氨苄西林（氨苄青霉素）,阿莫西林（羟氨苄青霉素）,普鲁卡因青霉素,头孢氨苄,头孢拉啶,头孢羟氨苄,头孢噻吩钠,酸性,结构特点与性质,一、,与碱金属(Na+、K+)成盐,（一）羧基,易溶于水,与有机碱(普鲁卡因)成盐,难溶于水,普鲁卡因青霉素,（二）手性C,头孢菌素类C6C7,青霉素类C3C5C6,旋光性,（三）共轭体系,青霉素类母核无明显UV多数有苯环取代基,UV,（四）内酰胺环,水溶液不稳定,干燥纯净稳定,不稳定性因素,四元环张力大,酰胺键易水解,例,青霉素的降解反应,（一）呈色反应,1.羟肟酸铁反应,-内酰胺类,呈色,羟肟酸衍生物,（红、棕、褐）,2.茚三酮反应,-氨基,蓝紫色,3.双缩脲反应,似肽键,紫,4.与重氮苯磺酸反应,橙黄色,重氮苯磺酸,-,-,5,6,OH,H,C,（偶合）,酚羟基,头孢哌酮,5.与变色酸-硫酸反应,活泼“-CH2-”,青霉素阿莫西林氨苄西林,（分解）,变色酸,显色,1.K+、Na+的火焰反应,（二）各种盐的反应,2.沉淀反应（青霉素盐）,遇酸,在过量HCl或有机溶剂中溶解,3.重氮化-偶合反应,重氮化-偶合反应,芳伯氨基,4.与三硝基苯酚反应,二苄基乙二胺,mp,三硝基苯酚,样品、分解产物,Cu2+,pH3.8,分子重排,2、,IR法,3180cm-1N-H,内酰胺C=O,1780cm-1,3470cm-1O-H,1690cm-1仲酰胺C=O,1250cm-1C-O,以阿莫西林为例,对照品对照法,三、杂质检查,药物检查项目检查方法头孢他啶聚合物HPLC法头孢曲松钠头孢哌酮钠头孢噻肟钠头孢呋辛酯有关物质和异构体HPLC法头孢氨苄有关物质反相TLC法青霉素钾（钠）吸收度紫外分光光度法,1.头孢他啶聚合物的测定固定相：葡聚糖凝胶G-10（40120m）流动相A：3.5%硫酸铵的0.01mol/L磷酸盐缓冲液流动相B：0.01%十二烷基硫酸钠对照品溶液：头孢他啶对照品100g/ml,1）系统适用性试验：理论塔板数和拖尾因子用1mg/ml蓝色葡聚糖2000、流动相A测定；重复性用对照品溶液、流动相B测定。N不低于900，拖尾因子0.751.5，峰面积的RSD应小于5.0%。2）测定方法进样供试液，用流动相A；进样对照液，用流动相B。以外标法计算，含头孢他啶聚合物以头孢他啶计不得超过0.3%。,2.头孢呋辛酯中有关物质和异构体的检查固定相：ODS流动相：0.2mol/L磷酸二氢铵-甲醇（62:38）1）头孢呋辛酯2-异构体的制备：头孢呋辛酯对照品+流动相头孢呋辛酯2-异构体。2）系统适用性试验：各异构体之间的R1.5，以头孢呋辛酯A异构体计算n1500。,3）异构体：tR1相对保留时间r12=-1-被测物tR22-标准物异构体相对保留时间判断B异构体0.85供试液谱图中A异构体的峰面积A异构体1.0与A、B异构体峰面积和之比应为0.480.55。,3.头孢氨苄中有关物质的检查-反相TLC法固定相：活化后的硅胶G板置5%（V/V）正十四烷的正己烷溶液中，展至顶部，凉干展开剂：0.1mol/L枸橼酸-0.2mol/L磷酸氢二钠-丙酮（120：80：3）供试液：本品50mg/ml对照液（1）：本品0.5mg/ml对照液（2）：-苯甘氨酸0.5mg/ml对照液（3）：7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸0.5mg/ml,结果判断：供试液如显杂质斑点，与对照液（2）（3）位置相同上所的斑点比较，其颜色不得更深；如显其他杂质斑点，与对照液（1）所显的主斑点比较，其颜色不得更深。,4.青霉素钠（钾）的吸收度检查：供试液1.80mg/ml，结果判断：A280不得大于0.10,水解产物,定量过量,剩余,ChP,四、含量测定,反应分两步进行：1.水解反应(按化学计算量进行)2.氧化-还原反应(无固定的量关系，受温度、PH值和时间等因素影响，应严格控制反应条件并采用标准品平行对照测定),第一步,第二步,V样空,V样,V对空,V对,空白试验,A、消除样品已降解产物的干扰B、消除样品中其他消耗碘的杂质的干扰C、消除碘挥发造成的误差,以未经水解的样品作空白测定,空白,样品,Na2S2O3,采用标准品平行对照测定,A、可消除温度、pH、操作、环境等条件的影响B、使本法测定结果与微生物检定法一致,（1）弱酸性pH4.5,碱I2IO3-+I-,酸普鲁卡因与碘在酸性条件下会产生复盐沉淀,（2）温度2426,温度38未水解的供试品亦消耗碘,（3）水解时间,以水解20分钟后的耗碘量最大,（4）反应时间,反应20分钟后，耗碘量随时间的变化较小，可减小含量测定的误差。,（1）灵敏度高,样品:碘=1:8,（2）反应条件、实验操作要求高,加试剂次序、反应时间、滴定速度相同,4I28I-,原料,制剂,SH,R,OH,-,-,青霉素族,（水解）,青霉素族,ChP,滴定,水解,(降),空,醋酸盐缓冲液,V,(NO3)2,Hg,pH4.6,滴定,样品,以未经水解的样品作空白测定,（1）水解必须完全,（2）汞盐滴定液用EDTA标定,（3）空白试验消除已降解产物干扰,（4）优点不需标准品,可见-紫外分光光度法,（三）,稳定剂,（1）原理,青霉烯酸硫醇汞盐,青霉素族,HgCl2,（咪唑）,（2）方法,对照品法,计算,pH9,（3）注意,侧链有-NH2时，需加醋酐先将其乙酰化后才能发生上述反应,红色,NaOH,羟肟酸衍生物,ChP,特点快速、高效、灵敏专属性强、重现性好一法多用（鉴别、检查、含测）,返回,第三节氨基糖苷类抗生素,链霉素双氢链霉素新霉素卡那霉素庆大霉素巴龙霉素,链霉胍+链霉糖+N-甲基-L-葡萄糖胺,链霉胍,链霉糖,N-甲基-L-葡萄糖胺,链霉胍,链霉糖,N-甲基-L-葡萄糖胺,D-葡萄糖胺+脱氧链霉胺+D-核糖+巴龙霉糖,巴龙胺,巴龙二糖胺,D-葡萄糖胺,脱氧链霉胺,D-核糖,巴龙霉糖,绛红糖胺+脱氧链霉胺+加洛糖胺,绛红糖胺,紫素胺,2-脱氧链霉胺,加洛糖胺,N-甲基-3-去氧-4-甲基戊糖胺,庆大霉素C复合物庆大霉素C1R=HR1、R2=CH3庆大霉素C2R=R2=HR1=CH3庆大霉素C1aR、R1、R2=H庆大霉素C2aR=CH3R1=R2=H庆大霉素C2bR=R1=HR2=CH3,多与硫酸成盐,碱性,（一）,链霉素pH57.5庆大霉素pH212,羟基胺结构,氨基糖苷类,H+,糠醛,羟甲基糠醛,-萘酚蒽酮,呈色,红紫色,甲基葡萄糖胺,巴龙霉素,链霉素,水解,-,N,吡咯衍生物,红色,（Elson-Morgan反应）,庆大霉素,红色,链霉素特征反应,紫红,麦芽酚,链霉胍特有反应,8-羟基喹啉,-萘酚,H+,庆大霉素无UV吸收,（八）色谱法,（1）TLC法：硫酸庆大霉素的鉴别点样：供试液：展开、凉干、碘蒸气中显色对照液判断：供试液与对照液所显斑点的颜色与位置应一致。点样：供试液对照液：硫酸链霉素标准品对照液：硫酸链霉素标准品+硫酸新霉素标准品+硫酸卡那霉素标准品,判定法：供试液中主斑点的位置、颜色、大小应与对照液相同，对照液应显示分离清晰的3个斑点否则试验无效。（2）HPLC法：硫酸庆大霉素的鉴别比较供试液与对照液各组分的保留时间。,链霉素B（甘露糖链霉素）,方法TLC中的对照品法（BP）,1.来源反应中间体,发酵菌种不同工艺差别,规定控制各组分的相对百分含量,ChPUSPBPJP,+,+,4,10,.,pH,吲哚衍生物,巯基醋酸,邻苯二醛,氨基,max=330nm,衍生化原理,1.,1-烷基硫代-2-烷基异吲哚衍生物,RPHPLC,规定C12550%C1a1540%C2a+C22050%,峰面积归一化法,微生物检定法各国药典主要采用,HPLC法常用于体内药分,返回,第四节四环素类抗生素,A,B,C,D,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,四环素（TC）tetracycline,金霉素(CTC)chlortetracycline,氯四环素,土霉素(OTC)oxytetracycline,氧四环素,多西环素(DOXC)doxycycline,脱氧土霉素,美他环素（METC）metacycline,pH37.5荧光,（二）旋光性,1.,差向异构化,差向金霉素,差向四环素,金霉素,四环素,-,4,-,4,6,2,pH,淡黄黑,蓝色荧光,差向四环素,（土霉素、多西环素不易差向异构化）,（1）酸性下降解,max=445nm,max=435nm,橙黄色,脱水四环素,TC,ETC,ATC,EATC,（2）碱性下降解,异四环素,四环素,盐酸土霉素的鉴别,EDTA克服痕量金属造成的拖尾现象,比较保留时间,三、,特殊杂质检查,4-差向四环素（ETC）脱水四环素（ATC）差向脱水四环素（EATC）盐酸金霉素（CTC）,HPLC法（2000版）,盐酸四环素,四环素有关物质TLC图,4,0.5,0.5,2,nm,max,355,268,l,、,盐酸四环素,杂质吸收度,取供试品配成每毫升10mg/ml的溶液至4cm的吸收池中，在530nm处测定，其吸收度不得超过0.12。,应严格控制温度和时间,HPLC法,盐酸四环素的测定系统适用性试验：盐酸四环素、有关物质及ATC峰间的分离度均应符合要求。定量方法：外标法以峰面积计。,返回,第五节抗生素类药物中高分子杂质的检查,1.高分子杂质分子量大于药物本身的杂质总称。,蛋白、多肽、多糖或抗生素与蛋白、多肽、多糖的结合物。主要来自于发酵工艺，致敏，如青霉噻唑蛋白、青霉噻唑多肽。药物的自身聚合物，来自于生产、贮存过程。可引发过敏。,外源性杂质,内源性杂质,3.高分子杂质的质控方法（1）凝胶色谱法测定高分子杂质：使高分子杂质与药物分离。（2）高分子杂质的控制方法-自身对照外标法原理：测定在Kav=0处药物缔合物的峰响应指标样品中高分子杂质的响应指标按外标法计算，得样品中高分子杂质相当于药物本身的相对含量。,（3）高分子杂质的分析方法简单测定系统：葡聚糖凝胶G-10（40120m）柱.HPLC系统:葡聚糖凝胶G-10柱.,返回,练习与思考,A型题,1.硫酸链霉素、硫酸青大霉素的鉴别方法是A.三氯化铁反应B.硫色素反应C.茚三酮反应D.与碱性