《提取与分离》PPT课件

天然药物化学,药学院药化教研室,第三节提取与分离,天然药物化学的研究是从有效成分或生理活性化合物的提取、分离工作开始的。在进行提取之前，应对所用的药材进行如下的考查：基源（学名）、产地、药用部位、采集时间与方法。还要系统查阅文献，以充分了解和利用前人的经验。（同一品种其含成分含量因产地、取材部位、采集时间、存放条件不同而有变化）,一、中草药有效成分的提取,提取是研究天然产物的一个重要步骤，常用的方法有溶剂提取法、水蒸气蒸馏法和升华法。,水蒸气蒸馏法：适用于有挥发性的能随水蒸气蒸馏而不被破坏且难溶或不溶于水的成分的提取。例如挥发油类成分。升华法：适用于具有升华性质的成分的提取。例如樟脑、咖啡因等溶剂提取法:选择适当溶剂将中草药中的化学成分从药材中提取出来。,(1).概念：根据天然药物中各种化学成分的溶解性能，选择对有效成分溶解度大而对其他成分溶解度小的溶剂，用适当方法将所需化学成分尽可能完全从药材组织中溶解提出的方法。溶剂的提取过程是溶剂对药材组织细胞不断作往返的扩散、渗透、溶解的过程，直至药材组织细胞内外溶液中被溶解的化学成分的浓度达平衡为止。,1、溶剂提取法,(2).溶剂提取法的提取原理：根据化合物在极性相似的溶剂中有较好的溶解性即“相似者相溶”这一原理进行的。,极性从低到高的顺序依次是：石油醚二硫化碳苯二氯甲烷乙醚三氯甲烷乙酸乙酯丙酮乙醇甲醇乙腈水Rfb可以利用纸色谱设计液-液萃取的最佳方案。,4.逆流分溶法（CCD）此法相当于多次萃取。,在No.0漏斗中溶入溶质并加入流动相。振摇使两相溶剂充分混合，静置分层后，分出流动相，令其移入No.1管，再在No.0管中补加新鲜流动相，再次振摇混合，静置分层并进行转移。如此连续不断地操作下去，溶质即在两相溶剂中，不断地重新分配并达到分离的目的。,6.液-液分配柱色谱,分配比不同，被洗脱速度不同,原理：,将两相溶剂中的一相涂覆在硅胶等多孔载体上作为固定相填充于色谱柱，然后加入与固定相不相混溶的另一相溶剂（流动相）进行洗脱。物质在两相溶剂中作逆流分布，在移动过程中不断进行动态分配而得以分离。,载体：有硅胶、硅藻上、纤维素粉正相色谱：固定相：水、缓冲液流动相：氯仿、乙酸乙酯、丁醇适合分离水溶性或中等极性的成分：生物碱类、苷类、糖、有机酸。用流动相洗脱时，极性小的成分先被洗脱。反相色谱：固定相：石油醚、异三十烷、石蜡油流动相：水、甲醇适合分离脂溶性化合物：高级脂肪酸、油脂、游离甾体。当用流动相洗脱时，极性大的成分先被洗下来。,（1）正相色谱和反相色谱,（2）加压液相柱色谱为了提高分液速度，缩短分离时间，在加压条件下进行分离，加压液相色谱用的载体多为颗粒直径很小，机械强度与比表面积比一般色谱用的硅胶大的球形微粒，按所加的压力不同可分为：快速色谱（FLC）2个气压，分离范围10mg-g低压液相色谱(LPLC)20个气压，分析型:分离范围ug-10mg制备型:分离范围mg-g,（三）根据物质的吸附性差别进行分离,原理：利用混合物中各成分对吸附剂的吸附能力不同而达到分离，其中固-液吸附用得最多，分为物理吸附，化学吸附及半化学吸附。,物理吸附：分子间力，无选择性，可逆。硅胶、氧化铝、活性炭化学吸附：化学键，选择性较强，常不可逆。硅胶生物碱碱性氧化铝黄酮、蒽醌等半化学吸附：氢键，选择性较弱，多可逆聚酰胺,1.物理吸附的基本规律相似者易于吸附(1)吸附过程中的三大要素：吸附剂、溶质、溶剂,（4）吸附柱色谱用于物质的分离在实际工作中硅胶与氧化铝柱色谱用的最多。,2.极性及其强弱判断极性强弱是支配物理吸附过程的主要因素。(1)官能团的极性强弱顺序:R-COOHAr-OHH2OR-OHR-NH2、R-NH-R、R-N-RRR-CO-N-RRR-CHOR-CO-RR-CO-ORR-O-RR-XR-H,(2)溶剂的极性根据介电常数（）的大小来判断常用溶剂介点常数,由大到小乙酸水甲醇乙醇丙酮乙酸乙酯氯仿乙醚（无水）苯己烷,3.吸附柱色谱用于物质的分离在实际工作中硅胶与氧化铝柱色谱用的最多。操作时需要注意的问题。（1）吸附剂与样品量的比例：3060：1极性小，难以分离的样品：100200：1色谱柱长度与内径比例：1520：1吸附剂的粒度：100目，难以分离的样品可采用200300目。粒度太细，谱带容易扩散，可采用加压色谱。,（2）样品与吸附剂的装柱吸附剂选用极性小的溶剂装柱，样品同样以湿法装柱。如果样品在极性小的溶剂中溶解度小，则改用极性大的溶剂溶解后，再用不到装柱量1/20的吸附剂拌匀，于60下加热挥散溶剂，研细后再小心铺在吸附剂柱上。,（3）洗脱用溶剂的极性应逐步增加往往采用梯度洗脱，实践中多用混合溶剂，一般混合溶剂中强极性溶剂的影响比较大。不可随意将极性差别很大的两种溶剂混合使用。对于极性较大的成分常用氯仿-甲醇，按不同比例梯度洗脱，对比较容易洗脱的极性小的成分，可用氯仿-乙醚或氯仿-乙酸乙酯。,（4）为避免发生化学吸附：酸性物质的分离选用硅胶、碱性物质的分离则选用氧化铝为好。碱性物质用硅胶分离时：在洗脱溶剂中加入碱性物质（氨、吡啶、二乙胺等）；酸性物质用氧化铝分离时：洗脱剂中加入醋酸等。（5）通过TLC进行筛选溶剂系统：在TLC展开时使组分Rf值达到0.2-0.3的溶剂系统，为柱色谱的最佳洗脱溶剂系统。,薄层层析是将作为固定相的支持剂均匀地铺在支持板（一般是玻璃板）上，成为薄层，把样品点到薄层上，用适宜的溶剂展开，从而使样品各组分达到分离的层析技术。,薄层层析,4.聚酰胺吸附色谱Polyamidechromatography,聚酰胺吸附色谱属于氢键吸附。对于极性物质和非极性物质都适用，主要适合分离酚类、醌类、黄酮类化合物。,聚酰胺的性质,1.高分子聚合物2.不溶于水和常用的甲醇、乙醇、乙醚及丙酮等有机溶剂3.对碱稳定4.对酸特别是无机酸稳定性差5.可溶于浓盐酸、冰乙酸、甲酸,聚酰胺吸附原理:氢键-半化学吸附,由于分子中含有酰胺羰基及游离胺基，在水溶液中能与含有酚羟基以及羰基的化合物通过氢键结合而被吸附，从而与不含上述基团的化合物分离。,吸附规律：形成氢键的基团数目越多，吸附能力越强易形成分子内氢键者，吸附相应的减弱分子中芳香化程度高，吸附作用增强,各种溶剂在聚酰胺柱上的洗脱能力水甲醇乙醇氢氧化钠水溶液甲酰胺二甲基甲酰胺尿素水溶液,化合物在不同溶剂中的吸附力，随溶剂极性增强而增强水中最强常以水装柱、样品以水溶解上样含水醇中次之醇中最弱常以浓度渐高的含水醇梯度洗脱EtOH-H2O最常用,弱,强,吸附规律：,操作：用水装柱,样品也尽可能的做成水溶液,使其充分被吸附,先用水洗,逐步提高醇的浓度。,聚酰胺色谱的应用：,醌类、黄酮类等酚性的制备和分离。脱鞣处理生物碱、萜类、甾类、糖类、氨基酸等极性与非极性化合物的分离也有用途,5.大孔吸附树脂,白色球形颗粒状，理化性质稳定。不溶于酸、碱及有机溶剂中，在天然化合物的分离与富集工作中广泛使用。（1）大孔吸附树脂的吸附原理：吸附性和分子筛性原理相结合，其吸附性是由于范德华引力或产生氢键的结果。分子筛性是由于其本身多孔性结构的性质。（2）影响吸附的因素：吸附剂表面性质；被吸附化合物结构；洗脱剂；PH值；温度的影响,（3）大孔吸附树脂的应用苷与糖类的分离，生物碱的精制，多糖、黄酮、三萜类化合物的分离。,（四）根据物质分子大小差别进行分离,天然有机物的分子大小不同，表现出不同的分子量，故可以根据分子量的大小进行分离。常用的方法有：透析法:利用半透膜的膜孔(透析袋、膀胱墨、火棉胶)凝胶滤过法：利用凝胶的三维网状结构。超滤法：利用分子大小不同引起的扩散速度的差别。超速离心法：利用溶质在超速离心引起的作用下具有不同的沉降性或浮游性。以上方法主要用于水溶性大分子化合物，如蛋白质、核酸、多糖类的脱盐精制及分离工作。,凝胶滤过法1.原理：凝胶滤过法（gelfiltration）是利用分子筛分离物质的方法。所用载体葡聚糖凝胶在水中不溶解，但遇水后膨胀成具有三维空间结构的球形颗粒。由于凝胶网孔半径的限制，大分子物质不能渗入凝胶颗粒内部，故只在颗粒间隙移动，并随溶剂一起先从柱底流出，小分子因能自由地渗入到凝胶内部，通过色谱柱时阻力增大，流速变慢，后流出。样品混合物中各个成分因分子大小各异，渗入凝胶颗粒内部的程度不一样，按分子由大到小的顺序先后流出得以分离。,凝胶三维网状结构的分子筛作用按分子量由大到小的顺序分离,2.凝胶的种类与性质,常用的有葡聚糖凝胶（Sephadex-G）和羟丙基葡聚糖凝胶(Sephadex-LH-20)。(1)Sephadex-G由平均分子量一定的葡聚糖与交联剂（如环氧氯丙烷）交联聚合而成，生成的凝胶颗粒网孔大小取决于所用交联剂的数量及反应条件。商品型号按交联度大小分类，并以吸水量多少来表示。例如Sephadex-G25.G代表凝胶，后附数字=吸水量X10ml/g。,(2)Sephadex-LH-20为Sephadex-G25经羟丙基化处理后得到的产物OH-OCH2CH2CH2OH，虽然羟基数一样，但碳原子数增加，不仅具有亲水性，也有一定程度的亲脂性。因此不仅可以在水中应用，也可在极性有机溶剂或与水组成的混合溶剂中膨胀，所以可用来分离水溶性成分和非极性成分。,3.凝胶的处理及再生,SephadexLH-20价格较贵。用过的凝胶可以反复再生使用多次，物质的洗脱过程也就是再生的过程。暂时不使用时可用水洗含水醇洗醇洗，最后浸泡在醇溶液中贮存于磨口瓶中。长期不用时可在以上处理基础上，减压抽干，再用少量乙醚洗净抽干，6080干燥后保存。,（五）根据物质解离度不同进行分离,天然有机化合物中，具有酸性，碱性及两性基团的分子，在水中多呈解离状态，可以用离子交换法或电泳技术分离。,1.离子交换法分离物质的原理以离子交换树脂作为固定相，用水或含水溶剂装柱。当流动相流过交换柱时，溶液中的中性分子及不与离子交换树脂交换基团发生交换的化合物将通过柱子从柱底流出，而可交换的离子则与树脂上的交换基团进行离子交换并被吸附到柱上，随后改变条件并用适当溶剂从柱上洗脱下来，即可实现物质分离。,（1）母核部分：由苯乙烯通过二乙烯苯交联而成的大分子网状结构，网孔的大小用交联度量表示。交联度越大，则网空越小，在水中越不易膨胀。,2.离子交换树脂的结构及性质,（2）离子交换基团部分：,阳离子交换树脂：强酸性（-SO3-H+）弱酸性（-COO-H+）主要用于生物碱的分离阴离子交换树脂：强碱性（-N+（CH3）3Cl-）弱碱性（-NH2，-NH-，-N=）主要用于酚性物质和氨基酸的分离,（1）用于不同电荷离子的分离在分离、追踪有效部位时很有用途。提取液通过强酸性阳离子和强碱性阴离子交换树脂，可以将提取物分成中性化合物、酸性化合物、碱性化合物和两性化合物。（2）用于相同电荷离子的分离如生物碱的分离，利用碱性强弱不同，采用弱酸性树脂可分离，但分离效果不好。,3.离子交换法的应用,水提液中酸性、碱性、两性化合物的分离,碱性,碱性不同的生物碱的分离,第四节结构研究法,结构研究是天然药物化学的一项重要的研究内容。合成西药：原料已知，反应条件一定时，事先可以预测得到产物的结构。中药化学成分：未知因素很多，对于微量物质难以采用化学方法确定结构，主要靠波谱分析的方法解决。,一、化合物的纯度检查,检查纯度的方法：外观、颜色、形态是否均一.测定各种物理常数，如熔点、沸点、比旋光度、折光率等.如果可能是已知物，用已知结构的对照品进行对照测定或测定它们的共熔点等.薄层色谱、纸色谱（三种展开系统均呈单一斑点）气相色谱、高效液相色谱.,二、结构研究的主要程序,对未知天然化合物的结构研究程序,三、结构研究中采用的主要方法,（一）确定分子式，计算不饱和度,1.元素定量分析配合分子量测定有机化合物的元素大多由C、H、O、N等组成，对组成元素的种类和比例的分析，可以通过元素分析的方法确定。分子量的测定方法目前最常用的是质谱法。2.同位素丰度比法有机化合物的主要元素均由相对丰度比一定的同位素组成，且质量相差12。3.高分辨质谱法（HR-MS）可将物质的质量精确测定到小数点后3位，通过比较精确质量可区分分子量相同的不同化合物。,不饱和度的计算u=/2/21：一价原子数如H、X：三价原子数，如N、P：四价原子数，如C、S,作用：用于确定分子量；求算分子式。提供结构信息，推测未知物结构。特点：应用范围广，进行同位素及化合物分析。分析速度快，可与色谱联用。灵敏度高，样品用量少（只需5-10g）,（二）质谱,三、结构研究中采用的主要方法,常用质谱技术及特点电子轰击质谱（EI-MS，electronimpactionization）场解析质谱（FD-MS，fielddesorptionionization）快速原子轰击质谱（FAB-MS，fastatombombardment）电喷雾质谱（ESI-MS，electrosprayionization）,（三）红外光谱（IR）,化学键的振动在红外光区引起的吸收谱图测定范围：波数6254000cm-1之间，其中1500cm-1以上为化合物的特征频率区，1500-600cm-1为指纹区。作用：主要用于定性分析，功能基的确认，芳环取代类型的判断等。优点：任何气态、液态、固态样品均可测定；每种化合物都有红外吸收；常规红外光谱仪价格低廉；样品用量少（只需5-10ug）,特征基团区,指纹区,（四）紫外-可见吸收光谱,电子由基态跃迁至激发态（、n）在紫外可见光区引起的吸收谱图测定范围：200700nm之间作用：对含有共轭双键、,-不饱和羰基、芳香化合物的结构鉴定有重要价值特定的吸收谱特征骨架类型的判断如：黄酮、香豆素、蒽醌加诊断试剂前后谱图的规律性变化取代情况的推断如：黄酮、香豆素,生色团：产生紫外吸收的不饱和基团，如C=C,C=O,O=N=O等；助色团：其本身是饱和基团（常含有杂原子），它连到生色团上时，能使后者吸收波长变长或吸收强度增加，如-OH,-NH2,-Cl等；红移（redshift）：由于基团取代或溶剂效应，最大吸收波长变长。蓝移（blueshift）：由于基团取代或溶剂效应，最大吸收波长变短。,（四）紫外-可见吸收光谱,（五）核磁共振谱,1HNMR测定中通过化学位移（）、谱线的积分面积以及裂分情况（重峰数及偶合常数）可以提供分子中的1H的类型、数目及相邻原子或原子团的信息。（1）化学位移（chemicalshift）：1H核因周围化学环境不同，其外围电子密度以及绕核旋转时产生的磁屏蔽效应也不同。不同类型的1H核磁共振信号将出现在不同的区域，据此可以进行识别。化学位移范围：在010ppm。,1.氢核磁共振(1H-NMR),特征质子的化学位移值,1,0,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,C3CHC2CH2C-CH3环烷烃,0.21.5,CH2ArCH2NR2CH2SCCHCH2C=OCH2=CH-CH3,1.73,CH2FCH2ClCH2BrCH2ICH2OCH2NO2,24.7,0.5(1)5.5,68.5,10.512,CHCl3(7.27),4.65.9,910,OHNH2NH,CR2=CH-R,RCOOH,RCHO,常用溶剂的质子的化学位移值,D,（2）峰面积：因为1HNMR谱上积分面积与分子中的总质子数相当，当分子式已知时，就可以算出每个信号所相当的1H数，积分值与氢的数目成正比。如乙醇的氢谱中CH3与CH2的谱峰积分值基本等与3:2。（3）信号的裂分及偶合常数：已知磁不等同的两个或两组1H核在一定距离内会因相互自旋偶合干扰而使信号发生分裂，表现不同裂分，如：s,d,t,q,m等。裂分间的距离为偶合常数（J，Hz）用以表示相互干扰的强度，其大小取决于间隔键的距离。,1.氢核磁共振(1H-NMR),（五）核磁共振谱,与氢谱一样，核磁共振碳谱也是采用相对值来表示化学位移，通常使用四甲基硅烷（TMS）作为13C化学位移的零点。有机化合物的13C共振化学位移范围是0200ppm，碳谱的化学位移范围较氢谱广得多，能够提供更多的信息。,2.核磁共振碳谱,（五）核磁共振谱,13C信号的化学位移：,脂肪碳：小于50连杂原子碳（C-O，C-N，C-S）：50100甲氧基碳（-OCH3）：55左右糖端基碳：95105芳香碳、烯碳：98160连氧芳碳：140165羰基碳：168220，具体：醛：190205；酮：195220；羧酸：170185；酯及内酯：165180；酰胺及内酰胺：165180,第一节绪论：掌握天然药物化学的概念，天然药物化学的研究内容，第二节生物合成：熟悉天然药物化学成分的主要的生物合成途径.第三节提取分离方法：掌握提取分离的各种方法和原理。第四节结构研究方法：掌握波谱法测定天然药物化学成分结构的一般原理和方法。,本章小结,一练习题,1.从中草药水煎液中萃取有效成分不能使用的溶剂为:A.Me2COB.Et2OC.CHCl