现代生命科学与生物技术-合成生物学PPT课件

.,1,合成生物学,化学化工学院黄磊,现代生命科学与生物技术,硕士研究生公共课程,.,2,第4章合成生物学,4.1概述4.2生物元器件4.3DNA的合成与元器件装配4.4合成生物的功能实现,.,3,4.1概述,4.1.1合成生物学的概念4.1.2合成生物学的发展4.1.3合成生物学的应用,.,4,4.1.1合成生物学的概念,包括人类在内的700多种生物的基因组已经被测序，在分子水平上研究基因的结构和功能成为现实合成生物学（syntheticbiology）是基于生命系统的工程技术，旨在设计、构建自然界不存在的生命或使已存在生命具有新功能合成生物学研究如何设计和构建人工生命，依靠人工开发的基因密码，按照预定的方式运行生命,.,5,相关背景,合成生物学是继人类基因组计划研究之后，生物领域的又一热门学科，是整体系统论生物学思潮在工程学领域的再现合成生物学是生物发展到一定阶段随之工程化的必然趋势科学家希望能够设计新生物体来满足一些特殊需要:让细菌吃进纤维素废物，排泄出石油把“生物砖”类比于半导体工业中的半导体元件，组装这些元件，让细胞干我们想让它干的事情采用基因工程方法将生物细胞“组装”成实用的机器或技术,.,6,合成生物学与计算机工程的层次比较,.,7,4.1.2合成生物学的发展,合成生物学是按照需要设计制造出具有不同性状的基因，再将这些基因集成到细胞中，形成具有特殊功能的人造生命1911年7月8日，柳叶刀出现“合成生物学”一词2000年以后，这一学科迅速发展，大量科学家将注意力转向该领域2004年MIT出版的TechnologyReview，将合成生物学评为“将改变世界的十大新技术”之一,.,8,合成生物学国际会议,2004年6月：美国MIT，第1届，SB1.02005年5月：美国UC-Berkeley，第2届，SB2.02007年6月：瑞士，第3届，SB3.02008年10月：香港，第4届，SB4.02008年5月，北京香山“合成生物学学术研讨会”合成生物学下一代的生物技术,.,9,合成生物学的标志性进展,长片段DNA合成技术：2004年染色体移植技术：2007年染色体组装技术：2008年1月，美国克雷格文特研究所人工全合成生殖支原体细菌完整染色体（已知的自然界中基因组最小的生物体：485个基因，58万个核苷酸；人类：10万个基因，30亿碱基对）“很多技术曾被视为对上帝的挑战，但恐怕没有一个像合成生物学一样，要面对直接的谴责”，自然杂志2007年写道：“上帝第一次有了对手”达尔文式的自然进化世界将被人造世界所取代,.,10,合成生物学为很多领域的研究提供新视角,生物学家：重建不同层次的研究对象，由此加深对生命活动和生命过程的理解化学家：创造新分子化合物物理学家：发现自然状态下分子的活动行为工程技术科学家：进行药物、生物材料和生物能源等工程设计与简单、低廉、高效的制造，满足人类和社会发展的需要,.,11,合成生物学与系统生物学,合成生物学的出现与系统生物学（systemsbiology）的发展密不可分；都遵从系统论，对生物系统的整体功能进行研究系统生物学将在基因、蛋白质、代谢物等多维分子水平获得大量的细胞行为知识和建立生物网络，为合成生物学提供理论和模型合成生物学可为系统生物学的定量分析提供模式生物,.,12,合成生物学与生物信息学、化学,基因组测序是遗传信息阅读和解码的过程，合成生物学是测序的逆过程合成生物学对生物信息学（bioinformatics）提出了更大的挑战，其设计和优化需要新的算法进行模拟和测试合成生物的过程是以原料核酸的高速合成为基础的，需要高效、低成本的化学合成技术提供支持目前常规化学方法合成一个碱基核苷酸的商业化价格是2元左右，新方法有望降低成本,.,13,合成生物学与基因工程,都以基因为操作对象，都需要核酸酶和连接酶作为剪切和组装的工具，都需要载体来承载基因，进行扩大繁殖和保存基因工程技术只能在较小的范围内对已经存在的生命进行改造合成生物学能够将分解的数个功能模块高并行合成并构建代谢电路，最终得到具有复杂功能的新生命合成生物学研究将降低关键技术成本，解决基因操作的经济性问题，在工程领域得到广泛应用,.,14,美国麻省理工学院的TomKnight一语道破了基因工程的困境：“由于缺乏标准化的DNA序列组合技术，使得每一次DNA组合反应既是解决研究题材的工具，本身也是一项实验”生物工程使用的方法和零件如果能够标准化，就能建立相容组件的设计库。观念与制造分开后，生物工程学家才有余力去构思更复杂的装置，利用更有效的工具（电脑辅助设计）来控制系统的复杂度,.,15,4.1.3合成生物学的应用,合成生物学的目的是工程应用而非科学研究，它吸引了更多的工程专家、信息专家共同研究合成生物学的核心观念是，认为生命的所有零件都能由化学方法来合成制造，进而通过工程化方式组装成实用的生命合成生物学的研究和实验仍然处在初级阶段,.,16,合成生物学的应用领域,生物医药领域：改造细胞，生产新型药物；重新设计更有效、更安全的生物治疗方法生物能源与新材料领域：重新设计生物质路线图，获取太阳能、清洁燃料和新能源，可降解塑料、碳纳米管等材料环境领域：设计和合成新功能微生物，用于清除水污染、清除垃圾、处理核废料等智能计算机与生物传感领域：生物机体的实时检测，细胞机器人在动脉中检测并清除导致血栓的动脉粥样硬化物质，探测化学和生物危险物和爆炸物的生物警报器,.,17,4.2生物元器件,4.2.1合成生物的单元4.2.2合成生物的设计与优化,.,18,4.2.1合成生物的单元基因元件与生物砖,基因（生物）元件（geneticelement）：是具有某种特定的生物学功能的DNA或RNA，是设计和合成生物的基本单位特性：信号接受和输入功能，信号发送和产物输出功能，调节信息流、代谢和生物合成的功能，和其他元件相互作用，具有特定的工作环境可以是功能元件：编码1个/组生化反应酶功能基因/基因簇也可以是界面调控元件：包括功能基因转录、蛋白质翻译与修饰、功能酶反应等的调控基因，如复制子、启动子、阻遏子、诱导子、转录因子、核糖体结合位点、转录终止子、翻译终止密码、酶切位点、选择标记等,.,19,部分基因元件及其对应的的图示,.,20,生物部件,生物部件（biologicalpart）是由一个或多个基因元件组成，最简单的能行使催化功能的生物部件，是完整的编码酶基因表达盒,.,21,生物砖,生物砖（biobrick）是标准化的基因元件，是具有可连接性末端（前后缀）的基因元件前后缀分别是两个核酸限制性酶切位点，该末端只能用于元件之间的连接前缀之后依次是测序引物、启动子、核糖体结合位点、功能基因、翻译终止密码、转录终止子,.,22,4.2.1合成生物的单元生物模块与基因电路,生物模块（biologicalmodule）是一组细胞内区域化的生物器件（biologicaldevice），它们由内在功能联系在一起，执行特定的复杂功能细胞内模块往往是具有特定功能的途径，如代谢途径、信号转导途径、调控途径等模块可以由生物砖通过某种逻辑关系构建而成，但功能必须完全清楚,.,23,与电子科学中的电路类似，在合成生物学中，不同功能的生物砖联接后，能像电路一样运行，形象地称为基因电路（geneticcircuit）,代谢途径模块可由代谢电路来执行，调控途径可由调控电路来完成基因电路可清楚地图示生物模块的物理结构和生物功能基因电路特点是：具有定量特性，有确定的应答阈值及明确的反应边界，生物砖容易被除去、替换、更改；还可实现非自然的功能,.,24,4.2.2合成生物的设计与优化,针对复杂生物系统，合成生物学设计的工程策略：标准化：是确立基本生物元件的方法、对生物功能的定义和特征描述；从系统生物学的角度，对基因组序列进行分门别类有助于定义生物功能解耦联：是把复杂问题简单化的过程，把复杂系统解分成具有独立功能的简单组分，把设计和装配分开，以便完成设计后，能有效装配成整体系统抽提：是建立元件和模块的层阶，分开和限制各阶层之间的信息交流，隐藏生物信息和管理的复杂性，形成简化的再设计的器件和模块，建立可识别界面的元器件库,.,25,生物砖的设计与优化,生化反应的高度抽提：一个反应对应一个酶，一个酶对应一个基因，即一个生物砖生物砖功能的运行模式：基因表达调控的操纵子模型，最小包括启动子、核糖体结合位点、生化反应功能基因、终止子；对于复杂的生物元件，赋予调控序列如增强子、衰减子、扩增子等生物砖的优化：对功能基因密码子、启动子、核糖体结合位点进行优化，使之适应于宿主中的高表达,.,26,基因电路的设计与优化,生物砖构建基因电路的困难是，把相同功能的不同生物来源的生物砖集成基因电路后，不一定具有功能基因电路设计与合成中最大挑战是如何优化，使基因电路实现相应的生物功能优化方法可以是基于数学模拟的理性设计，也可以是生物元件的直接进化,.,27,理性设计：生化反应建模元件进化：改变元件特性，包括碱基突变、改变转录和翻译动力学、操纵子的亲和力、转录因子的共结合活性等，关键在于对基因电路进化行为的筛选和效果的评价方法理性设计和直接进化的结合，是基因电路设计和优化的最佳策略,.,28,4.3DNA的合成与元器件装配,4.3.1基因定向突变合成技术4.3.2核酸的全化学合成4.3.3生物砖的合成与基因电路的集成4.3.4基因组的合成与装配,.,29,PCR把寻找目的基因和扩增目的基因两步操作并成一步。,PCR法，又称多聚酶链式反应，是近年来开发出来的基因工程新技术，它的最大优点是把目的基因的寻找和扩增，放在一个步骤里完成。,.,30,PCR反应系统中应包括下列成分（1）cDNA文库，内含目的基因DNA片段。（2）两条探针，分别与目的DNA的正链或负链的3末端互补。（3）DNA聚合酶通常用TaqDNA聚合酶（高温）,.,31,.,32,PCR反应分三步完成：,第一步90度高温下，使混合物的DNA片段因变形而成单链。第二步50度温度下，引物DNA结合在适于配对的DNA片段上。第三步70度温度下，由合成酶（DNA高温聚合酶）催化，从引物开始合成目的基因DNA。,.,33,PCR的三个步骤为一次循环，约需5-10分钟。每经一次循环，所找到的目的基因扩充一倍。经过30次循环，即可扩增109倍，总共只需几个小时。,.,34,4.3.1基因定向突变合成技术,基因突变是指DNA序列中碱基排列顺序的变化，包括点突变、易位、倒置、插入、缺失等合成生物学研究中，采用PCR技术，通过序列的定向突变，可以实现对原始基因序列优化，合成新的基因功能、基因转录调控区等，从而满足生物元件的设计要求主要包括重叠延伸PCR定点突变合成、大引物扩增PCR定点突变合成和片段PCR连接合成,.,35,重叠延伸PCR定点突变合成4种引物，3轮PCR优点：突变体回收率高，可在任何位点引入突变，快速简便缺点：错误率高，不能有效扩增大片段大引物扩增PCR定点突变合成3种引物，2轮PCR正反向引物具有显著不同的Tm值突变效率高，避免了两轮PCR之间的纯化步骤片段PCR连接合成多处需要突变将基因分为等长、重叠的片段，然后PCR扩增性连接,.,36,.,37,.,38,4.3.2核酸的全化学合成,大片段核酸的合成非常重要，是实现合成生物的关键技术大片段核酸的合成，先化学合成寡核苷酸，然后片段PCR扩增连接合成全长基因国际上的三家商业化公司，BlueHeronTechnology、DNA2.0和GENEART，提供数千碱基DNA的合成业务程序化的微芯片合成DNA是一种非常吸引人的技术，可望取得突破性进展,.,39,DNA的化学合成,基本原理：多步连续反应，固相亚磷酰胺三酯法，方向：35，先保护不参与反应基团、缩合反应之后再选择性脱除以形成专一的磷酸二酯键，单体为核苷亚磷酰胺合成反应步骤：脱保护（DMT），活化（H），连接，封闭，氧化（三价P-五价P）合成后处理：切割（3-OH），脱保护基（DMT），纯化（C18，OPC柱，PAGE，HPLC），定量（OD260）溶解和保存：-20,.,40,DNA的传统全化学合成原理,.,41,4.3.3生物砖的合成与基因电路的集成,MIT的标准生物元件库（RegistryofStandardBiologicalParts）已有2000个生物砖生物砖的标准化操作为了实现生物元件之间的高效连接，使核心元件具有普适性和通用性，必须对生物元件标准化成为生物砖基于核酸的酶切生化反应，元件具有唯一末端同尾酶（产生相匹配末端的酶）位点作为前后缀接头（linker）作为前后缀元件连接前用一种酶切开，形成可连接末端，与另一元件连接后，该酶切位点消失,.,42,基因电路集成,切割载体，使之线性化切割含有生物砖的载体，把生物砖分离出来连接酶把线性化的载体和生物砖连接在一起重复连接多个生物砖到一个载体中，集成基因电路,.,43,生物砖载体的基本结构,用于构建生物砖载体（biobrickvector）的骨架可以是分子克隆中的任意载体，具备可自主复制性、转移性、可选择标记性、不相容性和外源生物砖的整合性，由复制子、抗生素抗性基因、多克隆位点赋予生物砖载体的命名是pSBX，第一个是指复制子类型，X是指抗生素抗性标记，第二个是指载体的版本。如pSB1A3是指合成生物学质粒，具有pMBI复制子，氨苄青霉素抗性标记，第3版,.,44,生物砖载体的构建,首先用两种限制性内切酶消化构建好的生物砖（包括功能基因和抗性标记基因）消化载体，除去氨苄青霉素抗性标记把生物砖与线性载体连接把连接产物转化到大肠杆菌宿主细胞，筛选鉴定出生物砖载体,.,45,4.3.4基因组的合成与装配,新生物系统的全合成：基因组（软件）+细胞（硬件）核酸化学合成：100bp，PCR：几万个bp生物系统的合成中，基因组的合成和装配策略是，化学合成寡核苷酸，PCR合成和酶连接产生较长片段，在生物体内连接合成全长基因组合成全长双链，并连接到骨架上合成部分序列，间隔空缺由DNA聚合酶催化填补,.,46,全长基因的全合成研究,2002年，Cello等人合成了脊髓灰质炎病毒的cDNA2005年，Endy等人实现了噬菌体T7基因组的全合成2007年，CraigJ.Venter研究所实现了基因组在物种中的转移2008年，该所全合成了支原体Mycoplasmagenitalium的基因组,.,47,噬菌体T7基因组的设计与合成,重新注释野生型T7基因组确定基因的边界，定义基因元件的功能，选择正确的序列基因元件序列不能重复，一个基因元件编码唯一功能每个基因元件能够进行独立和准确的操作组装新基因组，使其具有生物学功能经过注释，从野生型噬菌体39937bp线性双链DNA中抽提得到57个ORF（开放阅读框），57个RBS（核糖体结合位点），60个蛋白，51个调控序列,.,48,基因组的设计,T7中基因2.8和基因3有重叠，基因3的RBS在基因2.8内部把自然RBS和起始密码进行同义点突变（用大写字母表示），即不改变基因2.8的编码氨基酸基因3的序列向右移动，与基因2.8之间由核酸内切酶分开T7.1中，基因2.8和基因3无重叠，为部件28和29这些功能基因元件组装成部件，再把部件组装成零件，最后由零件组装成基因组T7.1,.,49,基因组的合成,把功能基因元件组装成73个生物部件，每个部件包括一个或多个基因元件，基因元件间可能重叠，但部件之间无重叠边界部件组装成零件，零件边界由核酸内切酶位点予以限定，总共6个零件组成T7.1基因组T7.1基因组长度41326bp，其左端用人工合成的12179bp取代野生型的11515bp，改变或增加了1424bp,.,50,基因功能测试,合成基因组T7.1转染大肠杆菌和涂培养板进行测试新合成基因组T7.1能编码活噬菌体，感染大肠杆菌并在其中进行复制，形成噬菌斑，具有生物学活性说明自然生物系统可以再设计和重新合成,.,51,支原体基因组的合成,支原体是一种无细胞壁的基因组最小的细菌基因组序列长度580076bp485个蛋白质编码基因中，约100个是非必需的,.,52,设计与组装策略,原始序列按顺序等分成101个序列盒，5-7kb/盒4个序列盒组装1个A序列（A1-A25），长约24kb3个A序列组装1个B序列（B1-B8），长约72kb2个B序列组装1个C序列（C1-C4），长约144kb2个C序列组装成1个D序列（D1-D2），长约290kb2个D序列组装成完整基因组,.,53,.,54,基因组的组装技术,分别合成101个序列盒，相邻序列盒之间有重叠序列，测序确证并逐步连接第一个阶段：用BAC（细菌人工染色体）载体，大肠杆菌为宿主，离体重组，把连接后的序列由A到B再到C组装插入到BAC中，筛选鉴定得到C系列组装体第二个阶段：用YAC（酵母人工染色体）载体，酿酒酵母为宿主，离体同源重组D系列和整个基因组，转化到酵母中最终得到合成的支原体基因组JCVI-1.0，总长度为582970bp,.,55,4.4合成生物的功能实现,4.4.1青蒿素代谢电路设计与从头合成4.4.2高级醇燃料代谢电路设计与从头合成4.4.3生物成像4.4.4生物计算机,.,56,4.4.1青蒿素代谢电路设计与从头合成,根据目标产物在生物体内的合成过程，对不同生物来源的基因元器件进行组装，设计崭新的生物合成代谢途径，在异源生物宿主中表达，实现目标代谢物的高效生产是合成生物学研究的重要方面疟疾是世界上流行最广、发病率及死亡率很高、由热带寄生虫疟原虫引起的传染疾病，通过蚊叮咬而传播印度、拉丁美洲和非洲大陆国家的疟疾最为严重，威胁300500万人，每年约死亡100万人，用于治疗疟疾的费用每年约为18亿美元,.,57,疟原虫的致病过程,疟原虫先侵入肝细胞发育繁殖，再侵入红细胞内繁殖，引起红细胞破裂而发病临床表现为间歇性寒战、高热、贫血和脾肿大，且常伴有致命的合并症,.,58,抗疟疾药物青蒿素,青蒿素是从菊科植物青蒿中分离出来的有效单体，目前被WHO评价为治疗恶性疟疾唯一有效的药物青蒿素的治疗机理是作用于红细胞期疟原虫的膜系结构，干扰其线粒体功能绝大多数地区青蒿中青蒿素含量都很低，无利用价值青蒿素的化学全合成的工艺复杂，成本太高,青蒿素生产中，药源问题非常突出！,.,59,青蒿素的生物合成过程,青蒿素是萜类化合物，由异戊二烯基单元聚合和修饰而成，这个代谢途径涉及10余个功能基因生物界有两条合成萜类的途径除植物外的其他真核生物具有甲羟戊酸（MEV）的萜类合成途径原核生物具有脱氧木酮糖磷酸（DXP）的萜类合成途径植物同时具有MEV和DXP两种途径,.,60,关键中间产物：IPP（异戊烯焦磷酸），DMAPP（二甲基丙烯焦磷酸）,.,61,大肠杆菌生产青蒿素前体的设计与合成,2003年，美国加州大学伯克利分校Keasling等人在大肠杆菌中独立设计了两条青蒿二烯的代谢电路，由2-3个功能模块、九个基因构成DXP途径：大肠杆菌的脱氧木酮糖磷酸合成酶基因（dxs）、IPP异构酶基因（ippHp）和酰基转移酶基因（ispA）三个功能基因连接组成DXP代谢电路MEV途径：把酿酒酵母MEV途径引入大肠杆菌，由两个独立的表达载体pMevT和pMBIS组成MEV代谢电路,.,62,大肠杆菌的乙酰辅酶A硫解酶基因（atoB）、酵母的3-羟甲基戊二酸单酰CoA合成酶基因（HMGS或ERG13）、截短的3-羟甲基戊二酸单酰CoA还原酶基因（tHMGR1）连接在一起组成pMevT酵母的甲羟戊酸激酶基因（ERG12）、甲羟戊酸磷酸激酶基因（ERG8）和甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因（MVD1或ERG19）、大肠杆菌IPP异构酶基因（idi）、红球藻的法尼基焦磷酸合成酶基因（ispA）连接到一起组成pMBIS由于植物来源的基因在大肠杆菌中表达效果差，需要对青蒿来源的二烯合成酶（ADS）进行适合于大肠杆菌表达的密码优化和定点突变，实现青蒿二烯的高效表达,.,63,.,64,实验结果,DXP途径：把丙酮酸和甘油磷酸转化为青蒿二烯，产量达0.313g/mLOD600MEV途径：把乙酰辅酶A转化为青蒿二烯，产量达3.4g/mLOD600，比DXP途径高11倍11个小时的生产周期中，MEV途径合成青蒿二烯的浓度约为22.6mg/L，增加0.8%甘油可使浓度达到112.2mg/L实验室水平经工程放大到工业化生产实际，水平可达g/L量级,.,65,酵母生产青蒿素前体的设计与合成,2006年，Keasling等人进一步对青蒿素代谢途径进行设计，将大肠杆菌基因、青蒿植物基因与酵母基因进行优化，全新设计和合成了酿酒酵母中的青蒿素的代谢电路，成功实现了青蒿素的前体物质青蒿酸的生产首先，对FPP合成代谢途径进行修饰，增加上调基因tHMGR（双拷贝）、ERG20（编码FPP合成酶）、upc2-1（编码甾醇合成的转录因子）的过表达，抑制下调基因ERG9（编码鲨烯合成酶）表达，促进FPP的积累,.,66,其次，构建半乳糖诱导启动子（Pgal1）控制青蒿二烯合成酶基因（ADS）的酵母表达载体，促进FPP转化为青蒿二烯最后，从青蒿中分离鉴定出一个全长编码495个氨基酸残基的细胞色素P450基因（CYP71AV1）和催化该酶的NADPH细胞色素P450氧化还原酶基因（CPR），构建半乳糖诱导启动子控制的CYP71AV1和CPR共同表达的基因电路,.,67,.,68,实验结果,工程酵母细胞炼制工厂合成并向胞外分泌，在培养液中积累青蒿酸，青蒿酸占酵母干重的4.5工程酵母发酵4-5天的生产能力为100mg/L，其速度比从植物中提取要快将近100倍工程酵母的青蒿二烯产量达153mg/L，提高了500倍这一科研成果被评为2006年“世界十大科技进展之一”。Keasling等人的研究是合成生物学的一个里程碑该代谢电路通用于他汀类药物、番茄红素、胡萝卜素、虾青素、赤霉素等具有MEV代谢途径和异戊二烯类结构的化合物,.,69,4.4.2高级醇燃料代谢电路设计与从头合成,生物能源的问题目前大规模生产并用于车辆的生物能源主要是燃料乙醇和生物柴油燃料乙醇是通过淀粉发酵制备，原料是甘蔗、玉米等，生物柴油是通过脂肪酸的化学甲酯化炼制这两种燃料都存在与人争粮、争地，导致全球粮食和食品危机，引发对生物能源的争议燃料乙醇不是最理想燃料，能量密度比汽油低，其吸湿性不利贮运高级醇（四碳和五碳）的能量密度与汽油接近，无吸湿性，比乙醇挥发性低，可替代汽油目前除正丁醇外，没有从可再生资源中生产其他高级醇也没有鉴定出从葡萄糖生产高级醇的微生物采用合成生物学策略，通过合成代谢电路，使微生物生产长链醇，将成为新一代的生物燃料,.,70,高级醇的生物合成过程,微生物在氨基酸合成途径中产生的各种中间产物2-酮酸，是醇的前体从生化反应看，酮酸由酮酸脱羧酶（KDC）转化为醛，然后由醇脱氢酶（ADH）把醛还原为醇异亮氨酸2-酮丁酸2-酮-3-甲基戊酸丙醇2-甲基丁醇缬氨酸2-酮异戊酸异丁醇亮氨酸2-酮-4-甲基戊酸3-甲基丁醇苯丙氨酸苯基丙酮酸2-苯乙醇正缬氨酸2-酮基戊酸丁醇,.,71,.,72,高级醇代谢电路设计,在酮酸转化醇的过程中，关键酶KDC普遍存在于植物和酵母中，但细菌中不常见醛转化为醇的脱氢酶ADH普遍存在于多种微生物中Atsumi等人利用大肠杆菌已有的代谢途径，构建了kdc和adh基因的组成型表达电路，增加两步细菌本身不具备的生化反应，使氨基酸代谢中间产物合成醇，实现了高级醇的代谢电路设计微氧条件下，异丁醇产量达到300mM(22g/L)，增加酵母提取物增加细胞密度，40-112h产率达0.35g异丁醇/g葡萄糖，是理论产率的86丁醇产量达3.2mM,.,73,经验总结,大肠杆菌和酵母生长快速，兼性厌氧，适合于工业过程设计和大规模生产设计和表达代谢电路可能引起代谢不平衡，同时外源代谢产物的积累还会对宿主产生毒性为了目标产物的高效生产，所设计的代谢途径必须与宿主具有兼容性，协调一致,.,74,4.3.3生物成像,从生物学角度看，基因电路是细胞内基因转录和表达的级联调控事件程序化光调控基因的时空性表达，发射光谱，使菌落具有生物膜的功能，可产生高清晰度的二维成像可用于打印复杂的生物材料、研究信号转导途径Voigt等人基于光敏色素的感光原理，构建了感光器的基因电路，使细菌具有成像功能,.,75,成像基因电路设计,原理：光敏色素是双组分系统，由膜结合的胞外传感器和胞内蛋白应答调节器组成蓝细菌来源的光敏色素cph1基因与大肠杆菌胞内组氨酸激酶基因envZ融合，在四环素抗性基因启动子Ptet控制下组成型表达，构建光敏感基因电路在阿拉伯糖诱导启动子（Para）控制藻蓝胆素合成酶基因（pcyA和hol）的表达下，构建大肠杆菌的感光器藻蓝素的合成电路,.,76,工程细菌成像的基因电路设计,.,77,细菌成像,光传感器由光感受器（Cph1和PCB）和组氨酸激酶应答调节器（EnvZ）组成，红光抑制传感器的自磷酸化，关闭基因的表达黑暗中有活性（-半乳糖苷酶基因表达，把化学底物环己酮七叶苷-D-葡萄糖苷（S-gal）转化为黑色物质），在光下无活性（基因不表达，化学底物S-gal有颜色），实现了细菌的照相和摄影功能,.,78,.,79,细菌数码相机,CanonEOS1DsMarkII：1600万像素Leaf和Kodak：3400万和3900万像素BetterLight：1亿4千4百万像素Fermilab：五亿像素怪兽级传感器ChrisVoigt领导的UCSF研究团队，用大肠杆菌作为图像传感器的元素，成品将能拍摄出每平方英寸上亿像素的超清晰图像,.,80,打印细胞（PrintingCells）,美国马萨诸塞大学达特茅斯分院PaulCalvert等人使用喷墨盒来将干细胞“打印”成精确模式的干细胞，工程师们正将此技术应用探索打印细胞三维结构的途径颜色从黑白发展成各种颜色三维技术能够揭开细胞与细胞之间通信的秘密，在不久的将来，我们可能制造人类器官,.,81,4.4.4生物计算机,由于DNA的强大信息贮存和自组装能力，基于DNA离体自组装和蛋白质-DNA相互作用，科学家已经创造了生物计算机，但基于DNA的复制和细胞分裂的计算生物还没有为了实现在体计算，Haynes等人对大肠杆菌进行基因电路设计，创造出细菌计算机细菌计算机具有计算能力，可解决“翻煎饼难题”,.,82,数学“翻煎饼难题”,一堆不同大小的煎饼，每个煎饼都有黄色面和焦色面要求将最大的煎饼放在最底下并使得每个煎饼的黄色面朝上，操作的每一步只能一次操作一个或者连续几个煎饼，改变其顺序或者朝向以达到要求，步骤最少的路径为最佳解N个煎饼的总体排列数目是2n（n!），如6个煎饼需要46080次，12张煎饼有1.9万亿种可能，随着煎饼数目增加，排列数目对数级增加这就是“翻煎饼难题”，也是计算机领域的一个基本逻辑算法问题,.,83,翻煎饼基因电路设计,思路：翻煎饼是可逆的，可与基因的颠换相似一块煎饼可看成是一个功能模块化的DNA生物砖煎饼两个面可看成是基因分子两个末端（5和3端)基因元件具有特异性顺序（启动子+功能基因），DNA在细胞内由重组酶催化可翻转（即切割，颠倒，剪切和连接）解决策略：煎饼由可翻转的DNA片段组装而成DNA的复制时间和翻煎饼的步骤数相对应,.,84,翻煎饼的基因