免疫共沉淀--原理

因为你IP的时候用的抗体，为了说明是你的抗体特异性的IP下来的东西，而不是其他抗体IP下来的，所以要用IgG作为对照。当细胞在非变性条件下被裂解时，完整的细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间结合的保持下来。这一事实可被用于检测和确定生理条件下相关的蛋白质-蛋白质之间的相互作用。这种方法叫做免疫共沉淀IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。其优点为：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。缺点为：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用； （3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。实验流程为：（1）转染后24-48 h 可收获细胞，加入适量细胞裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解30min, 细胞裂解液于4C， 最大转速离心30 min后取上清；（2）取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液加1g相应的抗体加入到细胞裂解液，4C缓慢摇晃孵育过夜；（3）取10l protein A 琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗3 次，每次3,000 rpm离心3 min；（4）将预处理过的10l protein A 琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4C缓慢摇晃孵育2-4h，使抗体与protein A琼脂糖珠偶连；（5）免疫沉淀反应后，在4C 以3,000 rpm 速度离心3 min，将琼脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去，琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液洗34次；最后加入15l的2SDS 上样缓冲液，沸水煮5分钟；（6）SDS-PAGE, Western blotting或质谱仪分析。注意的问题：（1）细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（NP40或Triton X-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。不能用高浓度的变性剂（0.2SDS)，细胞裂解液中要加各种酶抑制剂，如商品化的cocktailer。（2）使用明确的抗体，可以将几种抗体共同使用（3）使用对照抗体：单克隆抗体：正常小鼠的IgG或另一类单抗兔多克隆抗体：正常兔IgG在免疫共沉淀实验中要保证实验结果的真实性，应注意以下几点：(1) 确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而并非外源非特异蛋白，单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生；(2) 要确保抗体的特异性，即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀；(3) 确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中，而不是由于细胞的溶解才发生的，这需要进行蛋白质的定位来确定。免疫共沉淀技术路线 准备工作： 预冷PBS，RIPA Buffer，细胞刮子（用保鲜膜包好后，埋冰下），离心机 1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS； 2. 加入预冷的RIPA Buffer（1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶，0.5ml/5106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶） 3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到1.5EP管中，4，缓慢晃动15min（EP管插冰上，置水平摇床上） 4. 4，14000g离心15min，立即将上清转移到一个新的离心管中 5. 准备Protein A agarose(琼脂糖珠)，用PBS 洗两遍珠子，然后用PBS配制成50%浓度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠 6. 每1ml总蛋白中加入100l Protein A琼脂糖珠（50%），4摇晃10min（EP管插冰上，置水平摇床上），以去除非特异性杂蛋白，降低背景 7. 4，14000g离心15min，将上清转移到一个新的离心管中，去除Protein A珠子 8. （Bradford 法）做蛋白标准曲线，测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释1：10倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响（定量，分装后，可以在-20保存一个月） 9. 用PBS将总蛋白稀释到约1 g/l，以降低裂解液中去垢剂的浓度，如果兴趣蛋白在细胞中含量较低，则总蛋白浓度应该稍高（如10 g/l） 10. 加入一定体积的兔抗到500l总蛋白中，抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异 11. 4缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2 h室温孵育 12. 加入100l Protein A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物，4缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1h，如果所用抗体为鼠抗或鸡抗，建议加2 l“过渡抗体”（兔抗鼠IgG，兔抗鸡IgG） 13. 14000rpm瞬时离心5s，收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，去上清，用预冷的RIPA buffer洗3遍，800l/遍，RIPA buffer有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合，可以使用PBS 14. 用60l 2上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起，轻轻混匀，缓冲液的量依据上样多少的需要而定（60 l足够上三道） 15. 将上样样品煮5min，以游离抗原， 抗体，珠子，离心，将上清电泳，收集剩余琼脂糖珠，上清也可以暂时冻-20，留待以后电泳，电泳前应再次煮5min变性。 RIPA Buffer配制： 基础成分： Tris-HCl（缓冲液成分，防止蛋白变性） NaCl（盐份，防止非特异蛋白聚集） NP-40（非离子去污剂，提取蛋白；用H2O配制成10%储存液） 去氧胆酸钠（离子去污剂，提取蛋白；用H2O配制成10%储存液；避光保存） 注意：准备激酶（致活酶）实验时，不要加去氧胆酸钠，因为离子型去污剂能够使酶变性，导致活性丧失。 RIPA蛋白酶抑制剂 苯甲基磺酰氟（PMSF）（用异丙醇配制成200mM的储存液，室温保存） EDTA（钙螯合剂；用H2O配制成100mM的储存液，PH 7.4） 亮抑酶肽（Leupeptin）（用H2O配制成1mg/ml的储存液，分装，-20保存） 抑蛋白酶肽（Aprotinin）（用H2O配制成1mg/ml的储存液，分装，-20保存） 胃蛋白酶抑制剂（Pepstatin）（用甲醇配制成1mg/ml的储存液，分装，-20保存） RIPA磷酸（酯）酶抑制剂 激活的Na3VO4（用H2O配制成200mM的储存液，见Sodium Orthovanadate Activation Protoco） NaF（200mM的储存液，室温保存） 注意：在准备做磷酸（酯）酶实验的时候，不加磷酸酯酶抑制剂 工作液配制： 配制100ml的modified RIPA buffe： 1. 称取790mg 的Tris-Base，加到75ml 去离子水中，加入900mg的NaCl，搅拌，直到全部溶解，用HCl调节PH值到7.4 2. 加10 ml 10%的NP-40 3. 加2.5 ml 10%的去氧胆酸钠，搅拌，直到溶液澄清 4. 加1 ml 100mM的EDTA，用量筒定容到100ml，2-8保存 5. 理论上，蛋白酶和磷酸酯酶抑制剂应该在使用当天同时加入（抑蛋白酶肽，亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制剂各100 l; PMSF, Na3VO4, NaF各500 l），但是PMSF在水溶液中很不稳定，30分钟就会降解一半，所以PMSF应该在使用前现加，其他抑制剂成分可以在水溶液中稳定5天。 各种成分在工作液中的终浓度： Tris-HCl: 50 mM, pH 7.4 NP-40: 1% 去氧胆酸钠：0.25% NaCl: 150 mM EDTA: 1 mM PMSF: 1 mM 抑蛋白酶肽，亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制剂: 各1 g/ml Na3VO4: 1 mM NaF: 1 mM 通过免疫共沉淀确定结合蛋白 1用磷酸盐缓冲液洗30块10 cm培养板上的适宜细胞。刮去每块板上的细胞到1 ml冰冷的EBC裂解缓冲液中。 2将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中，在微量离心机上4以最大速度离心15 min。 3收集上清（约30 ml）并加入30g的适当抗体，4摇动免疫沉淀物1 h。4加入0.9 ml的蛋白质A-Sepharose 悬液，4摇动免疫沉淀物30 min。 5用含900 mmol/L NaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物，再重复洗5次。最后，用NETN洗一次。 6吸出混合物的液体部分。加入800l的1SDS胶加样缓冲液到球珠中，煮沸4 min。 7将样品加入到大孔的不连续SDS-PAGE梯度胶中，在10 mA的恒定电流下电泳过夜。 8通过考马斯蓝染色观察蛋白质泳带。 9从胶上切下目标带，将其放到微量离心管中，用1ml 50%乙腈洗两次，每次3 min。 10 用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质，再将肽电洗脱。 11 通过窄孔高效液相色谱分离肽。将收集的肽在ABI 477A或494A机器上进行自动Edman降解测序。免疫共沉淀原理及实验方法 一 原理 IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“protein A”特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。目前多用精制的protein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的protein A就能吸附抗原达到精制的目的。 实验最需要注意点就是抗体的性质。抗体不同和抗原结合能力也不同，免染能结合未必能用在IP反应。建议仔细检查抗体的说明书。特别是多抗的特异性是问题。 其次，要注意溶解抗原的缓冲液的性质。多数的抗原是细胞构成的蛋白，特别是骨架蛋白，缓冲液必须要使其溶解。为此，必须使用含有强界面活性剂的缓冲液，尽管它有可能影响一部分抗原抗体的结合。另一面，如用弱界面活性剂溶解细胞，就不能充分溶解细胞蛋白。即便溶解也产生与其它的蛋白结合的结果，抗原决定族被封闭，影响与抗体的结合，即使IP成功，也是很多蛋白与抗体共沉的悲惨结果。 再次，为防止蛋白的分解，修饰，溶解抗原的缓冲液必须加蛋白每抑制剂，低温下进行实验。每次实验之前，首先考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原，过多则就不能沉降在beads上，残存在上清。缓冲剂太少则不能溶解抗原，过多则抗原被稀释。欲速则不达，确定好比例很必要二 准备： 器械微量高速冷冻离心机移液枪旋转盘电泳设备vortex震荡器液氮及组织粉碎器eppentube试剂细胞或组织蛋白定量kitSDS电泳试剂抗体(单抗时选择protein G,二抗选择抗鼠Ig兔血清)PBSNaN3proteinA sapharose试剂配制抗原蛋白溶解缓冲液1. RIPA缓冲液 (最终浓度) 1MTris-HCL(PH7.4) 5ml (10mM) 5MNacl 15ml (150mM) 0.5M EDTA(PH7.4) 5ml (5mM) 20%TritonX-100 25ml (1%) 10% DOC 50ml (1%) 10%SDS 5ml ( o.1%) TLCK 18.5mg (0.1mM) TPCK 35mg (0.2mM) DDW 395ml toal 500ml 另外，使用之前加1mMPMSF(PMSF溶在酒精，浓度100mM，-20度遮光保存。注意不易溶于水)2. NP40 lysis 缓冲液1MTris-HCL(PH7.4) 5ml (10mM)5MNacl 15ml (150mM)0.5M EDTA(PH7.4) 5ml (5mM)20%NP40 25ml (1%)TLCK 18.5mg (0.1mM)TPCK 35mg (0.2mM)DDW 450mltoal 500ml使用前加1mM的PMSF注意点： *Tris缓冲剂PH随温度变化，高浓度盐酸滴定时发热，冷却后PH增高。*反复使用PMSF要注意保管方法。*1和2的缓冲剂的区别在于界面活性剂。TritonX-100,NP40是非离子界面活性剂，作用温和，DOCSDS是离子性的强活性剂。注意忘记加TritonX-100，只加DOC，SDS，可能使抗体完全失去活性。1的蛋白变性效果强，可能损害抗原/抗体结合，2的作用温和，却可能造成抗原溶解不全。*两方都有EDTA，对抗原而言，二价离子Mg,Ca等是必要的。根据自己需要调节。EDTA用NaOH滴定。Protocol1 调制protein A sapharose protein A sapharose 5ml 溶于20ml含0.02%NaN3的PBS离心2000转2分，去上清，在沉淀加0.02%NaN3的PBS，离心后去上清，重复2次，最后沉淀加20ml含0.02%NaN3的PBS，冷藏保存用单抗做一抗