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文档简介

1、.,1,什么是质谱仪?,质谱仪是按照离子的质荷比(m/z)不同,来分离不同分子量的分子.测定分子量进行成分和结构分析. 离子的生成方式有失去或捕获电荷(如:电子发射,质子化或去质子化),.,2,主要组成部分: 1.进样部分 2.离子源 3.质量过滤器(分析器) 4.离子检测器,.,3,离子源,质量过滤/分析器,检测器,进样部分 样品板 LC或GC,EI源 FAB源 MALDI源 ESI源,Quadruopole Ion trap Time-of-flight,电子倍增器 闪烁计数器,+ + + +,+ + + + + + + + + + + + +,+,+,+,+,+,+,+,+,+,.,4,

2、进样部分,要求: 大气压下的样品要进入高真空的质谱仪,而不影响仪器的真空度。 方式: 进样板进样 进样头进样 毛细管进样(从气相色谱及液相色谱柱),.,5,C: MALDI 激光解吸附离子源 Matrix-Assisted laser Desorption/Ionization,MALDI源的出现解决了生物大分子的离子化难题,离子化过程与FBI有相似之处。 1、使用基质,但基质为固体。 2、 MALDI用脉冲激光束轰击样品和基质的共结晶。 对基质的要求是能吸收337nm紫外光并气化,能量由基质传给样品使样品一起气化并离子化。,.,6,.,7,.,8,常用基质,1、氰基4羟基肉桂酸 CCA 多肽

3、 2、3,5二甲氧基4羟基肉桂酸 SA 蛋白 3、龙胆酸(2,5二羟基苯甲酸 DHB 聚合物 4、吡啶甲酸 PA 5、3羟基吡啶甲酸 3HPA MALDI源由氮激光器产生短周期脉冲激光,产生的多为单电荷离子,效率很高,即使只有极少的样品也可分析,.,9,常用基质结构,DHB,SA,CCA,.,10,MALDI的优缺点,优点 1、质量数可达300,000Da。 2、attomole 至femtomole级灵敏度。 3、软电离方式,无或极少碎片离子。 4、耐盐(样品含盐可达毫摩尔浓度)。 5、适于分析复杂混合物。,缺点 1、分辨率低。 2、1000Da以下基质峰干扰。 3、激光解吸附离子化有可能使

4、样品光降解。 4、串联质谱功能较弱,除非接反射装置进行源后衰变测量。 5、不能分析非共价键相互作用。 6、定量时需要内校准。 7、如没有反射飞行装置,不能分析多肽修饰。 8、对各种赋形剂的容忍度低(如 含磷酸缓冲液,大于150mM的盐等。,11,.,Sample submission In solution, as concentrated as possible, volume 10-20 ul Minimum Concentration 10 pmol/microliter Use 200ul PCR-style eppendorf tubes,The sample should NOT

5、contain anyAzide SDSBrij 35 Tris baseCHAPS Triton X-100, Treduced Triton X-100DMSO TweenDMF ZwittergentGlycerol any other detergentPhosphate buffersSalts and buffers 100 mM,The following components are ACCEPTABLEAcetic or formic acidAcetonitrile, ethanolGuanidine/HCl 4MHexafluoroisopropanol up to 40

6、%MethanolSodium chloride 10 mMUrea 1M,.,12,D: ESI离子源Electrospray Ionization,4000v强电场中,样品溶液通过毛细管喷嘴喷出,带电液滴被静电场吸向质谱人口,同时伴随干燥或加热干燥气体吹送,使液滴表面溶剂挥发,液滴体积变小,表面电荷密度变大,当同种电荷之间的库仑斥力达到雷利极限时,突破表面张力,液滴爆裂为更小的带电液滴,这一过程不断重复,使最终的液滴非常细小,呈喷雾状,此时液滴表面电场非常强大,使分析物离子化,带单电荷或多电荷。 一般分析物分子量 2000Da带多电荷,.,13,.,14,NANO-ESI喷雾照片,.,15

7、,ESI特点,1、 ESI产生的生物大分子离子如多肽蛋白等常常带10个以上电荷,使得m/z大大减小,弥补了四极杆质量分析器等质量范围窄的缺点。 2、质谱图显示的是离子带不同电荷数的一系列质荷比峰,根据峰位置换算成质量数和电荷数。,.,16,电荷数和质量数的计算,已知 mj=(m+nj)/nj mk=(m+nk)/nk nj= nk+1 推算出 nj=(mk-1) /(mk- mj) nk=(mj-1) /(mk-mj) m=mjnj-nj =mknk-nk,m/z,相对丰度,mj,mk,.,17,ESI优缺点,优点 1、质量数可达70,000Da 2、灵敏度高达femtomole级。 3、软电

8、离,可观察生物分子非共价反应。 4、易于和LC串联,直接分析流速为1ml/min的LC洗脱液。 5、没有基质干扰。 6、适于联四极杆质量分析器、离子阱质量分析器做结构分析。 7、带多电荷,允许质量范围窄的设备检测高质量数的离子。 8、带多电荷,通过计算平均值给出更精确的质量数。 9、特别适于测多肽的修饰。 10、样品前处理简单可直接分析RP-HPLC脱盐处理的溶液。,缺点 1、耐盐能力低。 2、对某些化合物特别敏感,污染难清洗。 3、样品需先气化,混合物不适用。 4、带多电荷,在分析混合物时,产生混乱。 5、定量时需内校准。,18,.,质量分析器(过滤器),第一节:质量分析器的主要指标 A、质

9、量范围(/) 所能测量的质荷比范围 M+nH B、灵敏度 一定浓度样品产生响应时,最低的浓度值。,n,.,19,D、分辨率 质谱分辨不同质荷比离子的能力 分辨率R=M/ a =M/(M M) b a 公式定义为单峰的质荷比与其半峰宽之比 b公式定义为相邻的相交10的两个峰M M 按a 式计算的分辨率约为b式计算的两倍。,.,20,不同分辨率谱图效果,.,21,离子阱质量分析器,三维的四极杆,RF加在环形电极上。,.,22,质量分析器的串联,目的:碰撞诱导产生碎片离子,进行结构解析 Collision-induced dissociation(CID) Ion source ion daught

10、er ion granddaughter ion,选择离子,MS,CID,MS/MS,CID,MS/MS/MS,.,23,空间串联质谱仪,A、串联四极杆(三级四极杆) triple-Quadrupole Analyzer Q为过滤单元Q为碰撞单元Q为分析单元,.,24,.,25,时间串联质谱仪,A、离子阱质谱仪:,.,26,几种串联质谱优缺点对比,.,27,.,28,第五章、质谱在生物学中的应用,一、肽质量指纹谱鉴定蛋白。 二、串联质谱鉴定蛋白技术,.,29,三、肽序列标签技术,通过测部分氨基酸序列,结合此序列前后的离子质量和肽段母离子质量进行数据库检索,称为肽序列标签技术。,.,30,四、O

11、标记从头测序技术,蛋白酶解时,酶解液中H2 O和H2 O各占50, 酶解后肽段的羧基端上的羟基氧 O/ O丰度比1:1,使Y型离子系列的M+2/M同位素峰的丰度高于正常未标记 O的离子的同位素丰度比。,18,18,16,18,16,18,.,31,五、磷酸化蛋白质的鉴定,A:MA结合磷酸酶水解,磷酸化蛋白,MS,蛋白酶水解,MS,磷酸酶脱HPO3,MS,通过比较几级质谱图,比较质量数少80Da或80倍数的肽段。,.,32,B、串联质谱进行母离子、中性丢失 扫描,分析含HPO3的肽段产生的特征离子,直接从混合肽段中找出磷酸化肽段。,.,33,C、PRD-MALDI-MS用源后衰变技术寻找质量数少

12、80Da或98Da的肽段来判断磷酸肽。,.,34,D、用IMAC技术分离/富集磷酸肽对比前后质谱变化寻找磷酸肽。 IMAC immobilized metal affinity固相金属亲和色谱。IMAC 对磷酸肽有高选择结合能力,富集后用高PH或磷酸盐洗脱后测质谱。,.,35,E、磷酸化位点的确定,找到磷酸肽后,串联质谱子离子扫描模式对磷酸肽进行序列分析。,.,36,F、磷酸化定量分析,1、N稳定同位素标记法:,N培养基,14,15,N培养基,14,.,37,2、同位素亲和标记法,细胞池1,细胞池2,混合,消除氘,消除氢,亲和纯化,酶解,MS,磷酸肽或磷酸化蛋白在缄性环境下发生消除,同时用亲核

13、试剂攻击形成的双键并发生加成反应,亲核试剂一种为氘原子、一种为氢原子,再接上一个亲和标签(如生物素biotin),混合酶解,提取含biotin的肽段进行MS检测。,.,38,六、糖基化蛋白的鉴定,A、用糖甙内切酶切断糖链与蛋白链间的糖甘键,将反应前后的质谱图比较,可知糖链的平均质量。,.,39,B、糖基化位点的确定,先用蛋白酶酶解成含糖链和不含糖链的肽段,获得其肽质量指纹谱,再用糖苷内切酶切除糖链,其肽质量指纹谱将发生变化,含糖肽段发生丢失位移,通过网上数据库检索其序列,找到位点。,.,40,C、用凝集素直接提取含糖肽段,再结合质谱技术分析,凝集素对含糖肽段有专一亲和性,.,41,七、质谱在蛋

14、白质组学中的应用,A、稳定同位素代谢标记技术。前面已介绍 B、同位素亲和标签技术,ICAT,专一与Cys共价结合,.,42,优缺点,优点 1、兼容分析任何条件下的体液、细胞、组织中的绝大部分蛋白。 2、烷化反应在盐、去垢剂/稳定剂(如SDS、尿素盐酸胍等)存在下都可进行。 3、只分析含Cys残基的肽段,降低分析复杂性。,缺点 ICAT本身分子量较大(500Da左右)增加数据检索复杂性。 无法分析不含Cys的蛋白。,.,43,2DLC-MS的基本原理,.,44,Why 2D LC/MS?,可鉴定极端具有pI、疏水性、分子量的蛋白质 适合膜蛋白 重复性好 容易自动化 上样量大 高灵敏度(溶液酶切)

15、 可根据样品灵活配置(但最后一维一般为RP),.,45,Then why SCX/RP/MS?,SCX和RP的分离原理是互补的 SCX按荷电情况,PR按疏水性 流动相是兼容的 pH3,ACN/water/salt SCX流动相中的盐可以在RP时有效去除 Tryptic peptides 在SCX柱上可以有效保留 Tryptic peptides在SCX条件下是稳定的,.,46,Separation powerPeak capacities,2DE 500 - 10,000 protein spots Affinity Chromatography 2 Ion exchange Chromato

16、graphy 10protein level Gelfiltration 10 Reversed Phase Chromatography50 Ion Exchange Chromatography 25 Reversed Phase Chromatography 100peptide level 2DLC (IEX/RPC)2,500 Linear IT MSn18,000 mph*,*measurements per hour,.,47,Gel,Gel spot,Proteolytic peptides,Mixture of Proteins,Digestion,Proteolytic p

17、eptides,Digestion,LC,Protein Identification Workflows,Peak Finding,Peak list,Search of a Sequence Collection,Identified and Proteins,Protein Candidates,Significance Testing,Protein Function?,Sequence Similarity Search,.,48,RPC,IEX,RPC trap,RPC trap,on-line elution by salt plugs to trap column,IEX,of

18、f-line gradient elution with “classical”fraction collection,RPC,2D LC的三种配置形式,IEX,RPC,in-line MudPIT,.,49,on-line 2D-LC,优点 全自动 样品体积可根据后续RPC调整 在线脱盐、浓缩 自由选择缓冲盐,缺点 SCX峰容量有限 ACN浓度在IEX和RPC得一致 两相分离都没能在最佳状态下进行,.,50,off-line SCX with fraction collection,优点 两维分离都有可能在最佳状态下进行,得到最好分辨率和峰容量 可自由选择缓冲体系 样品体积可根据后续RPC调

19、整 速度快(只需一个SCX操作) SCX馏份可留待以后分析,缺点 自动化程度低,.,51,The secret behind sensitivityReducing column dimensions,75 m I.D. columns and 200 nl/min are the standard today,75 m I.D. columns and 200 nl/min are the standard today,.,52,Tandem MS,.,53,Data dependent MS/MS,基本原则 先做一次全扫描(full MS),记录个丰度最高的离子 然后依次对这X个离子进行C

20、ID, 做MS/MS(full MS2) 然后再做全扫描, 下一个data dependent MS/MS开始 Dynamic exclusion 某个离子在做了一定次数(比如2次)的MS/MS后,将在一定时间内(比如3min)不再作为侯选离子。,.,54,+,多肽的裂解,.,55,碎片离子的命名,.,56,Residue name (A-Z) monoisotopic massaverage mass A71.03711 71.0788 B114.53493114.59625 C103.00919103.1388 D115.02694115.0886 E129.04259129.1155 F147.06841147.1766 G57.02146 57.0520 H137.05891137.1412 I113.08406113.1595 J0.00.0 K128.09496128.1742 L113.08406113.1595 M131.04049131.1925 N114.04293114.1039 O0.00.0 P97.05276 97.1167 Q128.058581

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