目的基因的表达

1、第八章 目的基因的表达,第一节 基因工程中的基因表达,一、制约目的基因表达的因素 二、阅读框架 三、启动子的影响 四、终止子的影响 五、翻译过程对表达的影响,绝大多数的基因工程研究是以获得基因表达产物为目标。在构建重组体DNA分子和选择宿主细胞时，还须考虑外源基因表达的问题。 要求外来的基因在宿主细胞中能够准确地转录和翻译，所产生的蛋白质在宿主细胞中不被分解，而且最好还能分泌到细胞外,不论基因工程的研究目的如何，最终均涉及到目的基因的表达问题,当基因工程的目的为研究基因结构与功能的关系时，需将天然的或人工突变的基因片段插入含有一定报告基因的载体的适当部位，比较天然基因与突变基因对表达水平的影响

2、，从而分析目的基因的结构与功能的关系,外源基因是否插入在正确的阅读框架； 目的基因的有效转录（如启动子的作用）； mRNA的有效翻译（如SD序列等作用）； 转录后，翻译后的适当的修饰和加工过程,制约目的基因表达的因素,一、制约目的基因表达的因素 二、阅读框架 三、启动子的影响 四、终止子的影响 五、翻译过程对表达的影响,阅读框架是由每三个核苷酸为一组联接起来的编码序列。外源基因只有在它与载体DNA的起始密码相吻合时，才算处于正确的阅读框架之中。 构建一组载体，使每个载体与相对于起始密码ATG的转译位相的位点不同，分别与外源目的基因拼接，即可获得所有可能的三位位相，其中必有一种位相可以保证外源基

3、因处于正确的阅读框架中,用人工接头可以调节阅读框架。市售的同一酶切点的人工接头一般都有三种长度，经与DNA片段连接，并切割成黏性末端后，各相差一个核苷酸。 因此，选择适当的人工接头，就可使外源基因处于正确的阅读框架中,为了使外源基因表达，需要在基因编码顺序的5端有能被宿主细胞识别的启动基因顺序以及核糖体的结合顺序。 两种常用的方法能用来使外源基因在宿主细胞中顺利地表达： 1) 在形成重组体DNA分子时，载体的启动基因顺序和核糖体结合顺序后面的适当位置上连接外源基因。 2) 将外源基因插入到载体的结构基因中的适当位置上，转录和翻译的结果将产生一个融合蛋白。这种融合蛋白质被提纯后，还要准确地将两部

4、分分开，才能获得所需要的蛋白质,一、制约目的基因表达的因素 二、阅读框架 三、启动子的影响 四、终止子的影响 五、翻译过程对表达的影响,原核细胞的转录过程中，决定外源基因表达的关键因素是外源基因必须在载体DNA的启动子控制之下，而且启动子又能被宿主细胞中的RNA聚合酶有效识别,Roberts等(1979)构建了一系列重组质粒，各种质粒之间的区别仅在于启动子和结构基因cro之间的距离不同。将这些不同的重组质粒转化大肠杆菌后，发现cro蛋白质的水平在重组质粒间相差悬殊，最高值比最低值大2000倍,启动子与结构基因之间的距离在蛋白质翻译上有巨大作用,启动子有强弱之分，强启动子指导产生较多量的mRNA

5、，弱启动子指导下转录合成的mRNA很少。启动子的强度主要决定于启动子的结构。 在原核生物表达系统中，通常使用的可调控的强启动子有lac(乳糖启动子)、trp(色氨酸启动子)、PL和PR(噬菌体的左向和右向启动子)以及tac(乳糖和色氨酸的杂合启动子)等。 为了在原核细胞中表达真核基因，必须将其克隆在原核启动子的下游，才能在原核表达系统中被转录,一、制约目的基因表达的因素 二、阅读框架 三、启动子的影响 四、终止子的影响 五、翻译过程对表达的影响,若干非必须的转录本的合成，会使细胞消耗巨大的能量用于制造大量非必须的蛋白质； 在转录本上有可能形成一些不期望其出现的二级结构，从而降低了转译的效率；

6、偶然会出现启动子阻塞现象，即克隆基因启动子所开始的转录干扰另一个必要的基因或调节基因的转译,克隆基因末端的转录终止区的存在，可避免以下几种不利现象,有些强启动子会通读，干扰质粒的复制，结果使质粒的拷贝数反而下降。 所以，在基因内部的适当位置上存在着转录的终止区，就能够保证使质粒的拷贝数（也就是基因的表达效率）控制在一个正常的水平上,一、制约目的基因表达的因素 二、阅读框架 三、启动子的影响 四、终止子的影响 五、翻译过程对表达的影响,原核细胞在翻译水平上的调控是不严格的，只有RNA和核糖体的结合才是蛋白质合成的关键,影响翻译效率的因素主要有,1) SD序列与rRNA的16S亚基3端序列的互补程

7、度，是影响翻译效率的主要因素,2) 起始密码AUG与SD序列之间的距离以及SD序列的核苷酸组成也影响翻译能力,连接在SD序列后面的4个碱基成分的改变也会对转译效率发生很大的影响。如果这个区域是由4个A(T)碱基组成，其转译作用最为有效；而当这个区域是由4个C碱基或4个G碱基组成，其转译效率只及最高转译效率的50或25,3) 起始密码之后的一个核苷酸对mRNA与核糖体的结合也有影响；直接位于起始密码子AUG左侧的密码三联体的碱基组成，同样会对转译的效率发生影响,例如-半乳糖苷酶的转译，当AUG左侧的密码三联体为UAU或CUU时，其转译最为有效；而如果是UUC，UCA或AGG，那么它的转译水平将下

8、降20倍,4)翻译的起始包括活化的30S核糖体亚基和mRNA5末端区域间的互作，这时mRNA的5末端已折叠成特殊的二级结构，基因表达水平的改变是mRNA二级结构的反映,翻译的起始是决定翻译水平高低的一个重要因素。由于紧随起始密码下游的几组密码子不同，可使基因的表达效率相差1520倍。这主要是改善了翻译的起始和mRNA的二级结构,5) 基因末端的转录终止区的影响。 外源末端除要安装好的启动子，还要注意终止区的设置,第二节 大肠杆菌原核表达体系,一、大肠杆菌表达系统的特点 二、大肠杆菌表达融合蛋白 三、大肠杆菌细胞包含体 四、提高克隆基因在大肠杆菌表达效率的途径,大肠杆菌是基因工程采用最多的蛋白质

9、表达体系。 原因是：培养方法简单、迅速、经济而又易于掌握，再加上人们运用大肠杆菌表达外源基因有三十多年的经验,运用大肠杆菌表达外源基因，必须采用符合以下条件的载体： 含大肠杆菌适宜的选择标志； 具有能控制转录、产生大量mRNA的启动子，如lac、tac启动子等； 含适当的翻译调控序列如核糖体结合位点和翻译起始点ATG； 具多聚接头，以确保目的基因按一定方向与载体正确连接,大肠杆菌表达体系的缺点： 表达的真核蛋白质不能形成适当的折叠或糖基化修饰； 表达的蛋白质常常形成不溶性的包含体，要使其具有活性还需要经复性等处理； 很难大量表达分泌性蛋白质,一、大肠杆菌表达系统的特点 二、大肠杆菌表达融合蛋白

10、 三、大肠杆菌细胞包含体 四、提高克隆基因在大肠杆菌表达效率的途径,对于外源基因（尤其是真核基因），利用融合表达的方法在大肠杆菌中表达有很多优点： 1）由于外源基因一般是被连接到可供融合的蛋白的C端编码序列之后，因此不需另外设计SD序列，同时，N端融合基因的存在，使得外源基因的表达相对比较容易,2）外源基因的表达产物常常会被宿主细胞的蛋白酶所降解，当外源基因与宿主本身的某种蛋白(如-半乳糖苷酶)的部分编码序列构成融合基因，以融合蛋白的形式表达时，往往会减低宿主细胞对产物的降解,3) 通过融合表达为蛋白纯化提供便利： 将外源目的基因与一段“亲和手柄”的编码序列相连接，这段“亲和手柄”可以与亲和层

11、析柱上的配基特异性地结合，这样所表达的融合蛋白可以用亲和层析的方法快速而简便地纯化出来。 所得到的融合蛋白经化学方法或酶法切割开来之后，混合产物再上同一亲和柱，充作“亲和手柄”的一段多肽或蛋白以及尚未被切开的融合蛋白被吸附于柱上，而重组目的产物则处于流动相中。这样，经过比较简单的几步即得到较高纯度的重组目的蛋白,4) 通过融合表达的方式促使产物以包含体的形式表达，产物表达量往往比较高。 5) 通过融合表达使产物以可溶性的方式表达。 6) 融合蛋白是避免细菌蛋白酶破坏的最好措施,一、大肠杆菌表达系统的特点 二、大肠杆菌表达融合蛋白 三、大肠杆菌细胞包含体 四、提高克隆基因在大肠杆菌表达效率的途径

12、,某些目的蛋白在大肠杆菌的表达形式是细胞内的包含体。 外源目的基因产物在大肠杆菌宿主中有可溶性表达与包含体表达两种形式,可以避免宿主的降解。 当以包含体表达时，目的基因产物的表达量也往往比较高， 包含体容易纯化，往往仅通过简单的差速离心及洗涤等几步即可得到较高纯度的目的蛋白。 当所表达的重组蛋白产物对宿主细胞具有毒性时，使重组目的产物以无活性的包含体形式表达可能是蛋白表达的最佳方式,包含体表达的优点,当以包含体形式表达时，外源目的蛋白表达产物需经过变性、复性等手段才能得到有生物活性的蛋白。而提取的手段复杂，并且回收率较低。 未形成包含体的水溶性活性物质在提取过程中容易损失,包含体表达的缺点,虽

13、然目的基因产物以包含体形式表达有不少优点，而且近年来随着蛋白复性技术研究的发展，许多目的基因产物得以通过包含体变性、复性的方法以一定的收率得到最终的产品。 然而迄今对于包含体的复性尚未有一个普遍适用的有效方法。适宜的复性条件一般都是经过实验摸索而得出，并且这些条件往往随目的蛋白的不同而不同。 另外，生产规模的包含体变性复性的产物纯化过程，其费用亦相对较高,如何能在大肠杆菌中直接表达出已正确折叠的有生物活性的重组目的蛋白，引起众多研究者的兴趣，并成为近年来大肠杆菌表达研究的热点之一,一、大肠杆菌表达系统的特点 二、大肠杆菌表达融合蛋白 三、大肠杆菌细胞包含体 四、提高克隆基因在大肠杆菌表达效率的

14、途径,为了在大肠杆菌中合成某种特殊的真核生物的蛋白质以满足商品生产的广泛需求，仅仅停留在检测水平上的表达是远远不够的，所以，必须设法提高克隆基因的表达效率。 许多因素诸如启动子的强度、DNA转录起始序列、密码子的选择、mRNA分子的二级结构、转录的终止、质粒的拷贝数以及质粒的稳定性和寄主细胞的生理特征等，都会不同程度地影响到克隆基因的表达效率，因而从分析这些因素入手就能够寻找提高克隆基因表达效率的有效途径,通过表达载体将外源基因导入宿主菌，并指导宿主菌的酶系统合成外源蛋白； 外源基因不能带内含子，必须用cDNA，而不能用基因组DNA； 利用原核细胞的强启动子和SD序列等调控元件控制外源基因的表

15、达； 外源基因与表达载体连接必须形成正确的开放阅读框架； 利用宿主菌的调控系统，防止外源基因的表达产物对宿主菌的毒害,1. 外源基因在原核细胞中表达必须满足的条件,1）启动子结构对表达效率的影响。 （2 ）转译起始序列对表达效率的影响。 （3）启动子同克隆基因间距离对表达效率的影响。 （4）转录终止区对克隆基因表达效率的影响,2. 外源基因在原核细胞中高效表达需注意的因素,限制蛋白质合成的第一步，是发生在核糖体同mRNA分子结合的过程中的。 由于细胞中核糖体的数量与mRNA分子相比是大大超量的，因此，提高克隆基因表达效率的途径之一是增加相应的mRNA分子的数量,5）质粒拷贝数及稳定性对表达效率

16、的影响,影响mRNA分子合成速率的因素有两种： 第一种是启动子的强度； 第二种是基因的拷贝数。提高基因的拷贝数(即基因的剂量)最简单的办法是，将基因克隆到高拷贝数的质粒载体上,根据实验观察，随着重组体克隆基因表达水平的上升，寄主细胞的生长速率便会相应地下降，同时形态上也会出现一些明显的变化，例如细胞纤维化和脆弱性增加等。 如果细菌由于产生出某种突变而失去了重组质粒，或是经过结构的重排使重组基因无法再行表达，或是质粒的拷贝数大大降低，那么这样的突变菌株便会有很高的生长速度，迅速地成为培养物中的优势菌株。而具有重组质粒的寄主细胞，最终便会被“稀释”掉，使克隆基因无法得到表达。由缺陷性分配引起的质粒

17、丢失现象，叫做质粒分离的不稳定性,6）提高翻译水平常用的途径 调整SD序列与AUG间的距离； 用点突变的方法改变某些碱基； 增加mRNA的稳定性。 细菌的mRNA的半衰期很短，一般仅为12min，而外源基因mRNA的半衰期可能更短。若能增加mRNA的稳定性，则有可能提高外源基因的表达水平。研究表明，大肠杆菌的“重复性基因外回文序列”具有稳定mRNA的作用，能防止外切酶的攻击。因此，在外源基因下游插入此序列或其他具有反转重复顺序的DNA片段可起到稳定mRNA、提高表达水平的作用,7）减轻细胞的代谢负荷 外源基因在细菌中高效表达，必然影响宿主的生长和代谢；而细胞代谢的损伤，又必然影响外源基因的表达

18、。 合理地调节好宿主细胞的代谢负荷与外源基因高效表达的关系，是提高外源基因表达水平不可缺少的一个环节,诱导表达，使细菌的生长与外源基因的表达分开。将宿主菌的生长与外源基因的表达分开成为两个阶段，是减轻宿主细胞代谢负荷的最为常用的一个方法。一般采用温度诱导或药物诱导。 例如应用tac启动子时，常用Ftac4的菌株或者将Lac I基因克隆在表达质粒中。当宿主菌生长时，Lac I产生的阻遏物与Lac操纵基因结合，阻碍了外源基因的转录及表达，此时，宿主菌大量生长。当加入诱导物(如IPTG)时，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则外源基因大量转录并高效表达,减轻细胞代谢负荷的方法,表达载体的诱导复制，减轻宿主

19、细胞代谢负荷的另一个措施是将宿主菌的生长和表达质粒的复制分开。当宿主菌迅速生长时，抑制质粒的复制；当宿主菌生物量积累到一定水平后，再诱导细胞中质粒DNA的复制，增加质粒的拷贝数，拷贝数的增加必然导致外源基因表达水平的提高。 例如质粒pCll01的温度控制诱导复制。用此质粒转化宿主菌，25时宿主中仅有10拷贝，宿主细胞大量生长；当温度升高到37时，质粒大量复制，每个细胞中质粒拷贝数可高达1000个,减轻细胞代谢负荷的方法,克隆一段原核序列，表达融合蛋白。 采用某种突变菌株，保护表达蛋白不被降解。例如大肠杆菌蛋白酶的合成主要依赖次黄嘌呤核苷(lon)，因此采用lon-缺陷型菌株作受体菌，则使大肠杆

20、菌蛋白酶合成受阻，从而使表达蛋白得到保护。 表达分泌蛋白(运用分泌型表达载体,8）提高表达蛋白的稳定性，防止其降解,第三节 真核表达体系的特点与 外源基因在真核细胞表达,利用真核细胞作宿主表达系统的优点,1）真核细胞具有一系列剪切酶，能够识别和除去外源基因中的内含子，剪接加工形成成熟的mRNA。 含有内含子的天然基因在真核细胞中是可以利用的，这是原核细胞办不到的，它不像原核细胞表达体系那样必须从mRNA制备cDNA,利用真核细胞作宿主表达系统的优点,2）真核细胞将表达的蛋白糖基化，而大肠杆菌表达的蛋白是没有糖基化的，糖基化对某些表达蛋白的免疫原性影响很大，有利于保持或提高目的蛋白的免疫原性,真

21、核细胞作宿主表达系统存在问题,1) 选择标记及选择系统只有少数几个； 2) 外源基因导入真核细胞效率（转化率）较低，一般只有10-610-4,3) 外源基因转移并整合到细胞染色体DNA上带有一定的自发性和盲目性，整合的拷贝数和位置都还不能控制； 4) 细胞培养及细胞的挑选要求比较高，手续繁琐费时，细胞大量培养还有不少问题，而且成本较高,真核细胞作宿主表达系统存在问题,第四节 酵母表达体系,酵母表达系统已被成功地用于生产人类、动物、植物或病毒来源的异源蛋白，获得了一些用传统方法无法得到的异源蛋白，还可对医药相关的蛋白结构和功能进行研究，如对重组蛋白进行研究，设计和筛选药物,酵母能像细菌一样在廉价

22、的培养基上生长，方便地用于外源基因的操作； 作为真核生物，它提供转译后加工和分泌的环境，使得产物与自然蛋白一样或类似； 可将异源蛋白与N端前导肽融合，指导新生肽分泌，在分泌中可对表达的蛋白进行糖基化修饰,酵母宿主用于表达高等真核生物重组蛋白的优点,采用高表达的启动子，如MOX、AOX、LAC4等基因的启动子，而且可诱导调控； 酵母能像高等真核生物一样移去起始甲硫氨酸，这样可避免在作为药物使用中引起免疫反应的问题； 酵母细胞也可进行N-乙酰化、C-甲基化，对定向到细胞膜的蛋白表达有重要作用,酵母宿主用于表达高等真核生物重组蛋白的优点,一酿酒酵母中外源基因的表达,第一个用于生产重组蛋白的酵母为酿酒

23、酵母（S. cerevisiae）。 要在酵母中最大限度表达基因，需要特异的启动子（乙醇脱氢酶、同工酶-、磷酸甘油激酶、酸性磷酸酶和因子等基因的启动子,通过重组DNA技术，可以利用酿酒酵母生产医用的外源蛋白。 用酵母生物技术方法得到的第一种医用产品是乙型肝炎疫苗。其他类似产品包括组织型血纤维蛋白溶源激活因子、胰岛素和水蛭素,由于酿酒酵母不能识别和处理高等真核内含子，因而须使用cDNA。 酵母生产外源蛋白的最佳表达盒包括有效的启动子序列（可为诱导性或组成性），目的蛋白cDNA和转录终止序列,使用酿酒酵母表达系统需考虑问题： 启动子和终止子的选择； 表达盒的稳定性； 外源蛋白的累积部位； 产量的提

24、高,二甲醇酵母中外源基因的表达,甲醇酵母，如Pichia pastoris和Hansenula polymopha，既保持了酿酒酵母的优点，还能大幅度提高产量，部分解决了糖基化问题，能在简单的培养基上利用甲醇为惟一碳源,在利用甲醇路径中，第一个用在P. pastoris中的酶为乙醇氧化酶(AOX)，在H. ploymorpha中为甲醇氧化酶(MOX)，而且AOX/MOX表达为高度调控的，完全诱导都需要甲醇的存在。 在甲醇中生长时，这些酶约占细胞蛋白总量的30。表达AOX/MOX的强大可调控启动子已用于生产重组蛋白。其表达框能够与宿主整合，并在非选择生长时保持稳定,P. pastoris 表达载

25、体包括AOX启动子、 AOX序列、 AOX终止序列，其中的多个克隆位点供外源基因插入，以组氨酸脱氢酶基因(HIS4)为互补性筛选标志，还包括部分pBR322质粒序列，使之成为在大肠杆菌中繁殖的穿梭质粒。 将表达载体酶切后线性化，整合于酵母基因组AOX或HIS4基因位置，可随酵母生长稳定地存在。甲醇酵母能大量分泌异源蛋白，对质粒也能发生高频整合，用一系列方法可增加拷贝数，提高产量,三酵母表达外源基因的缺陷和解决方法,1）在转译异源蛋白时，遗传和转译的稳定性常受影响，如点突变等。 点突变可通过大量的基因拷贝数解决，原因是突变会被大量的正常基因覆盖掉。 2）转译产物不稳定，可利用蛋白酶缺陷型菌株来解

26、决，防止产物降解,3）转译错误可通过对DNA修改来防止，如选用酵母合适的密码子以避免错误地插入tRNA和由于使用酵母中稀有密码子而引起的转译中断和移位，以提高正确的产物产量。 4）要得到有活性的成熟产物，选择转译后具修饰能力的酵母及合适的载体,5）生产分泌蛋白时，能够糖基化和形成二硫键，而且能在信号肽的引导下进行分泌，但用KEX2蛋白酶除去-因子的前导肽序列常不够完全，导致分泌蛋白有一个过长的氨基酸末端。 可采用氨基末端间隔序列解决，在-因子的前导肽序列和产物之间加1个间隔序列，这个间隔序列肽可在体外或体内用特异蛋白酶或酵母天冬氨酰蛋白酶切除,6）糖基化 酵母能进行N-糖基化，但主要是甘露糖型

27、；还会发生过糖基化，而这样的糖基化会导致潜在免疫性。 改变表达宿主糖基化背景能使产生的糖蛋白符合要求，但由于每种糖蛋白糖基化都不同，因而要分别测试所要表达的各种临床中使用的糖蛋白,7）蛋白折叠和分泌 在酵母中蛋白表达很高，如人血清白蛋白在P. pastoris中可达4g/L，但有一些蛋白分泌后折叠错误，滞留在ER腔内。 通过真核生物表达路径的限制以保持正确的腔内三维结构，但对腔内蛋白在折叠和分泌中的作用还不清楚，这是阻碍酵母表达系统发展的一个难题,第五节 昆虫细胞表达体系,昆虫表达系统是一类应用广泛的真核表达系统，它具有同大多数高等真核生物相似的翻译后修饰、加工以及转移外源蛋白的能力。 由于昆

28、虫及昆虫细胞来源广，管理和操作方便，又很经济，是值得发展开拓的基因表达体系,利用重组杆状病毒在昆虫细胞系中表达外源蛋白是目前较为流行的表达系统，以核型多角病毒(NPV)的蛋白基因的强启动子建立的表达载体系统是极有潜力的新型表达载体系统。 家蚕核型多角病毒(BmNPV)作外源基因的表达载体，宿主范围窄，安全性能好，家蚕容易饲养，特别是人工饲料技术的发展，可以大规模无菌饲养，便于大量生产外源基因产物，而且成本低廉。表达产物能向细胞外分泌，生物活性高。 目前已成功地在家蚕体内表达人干扰素等基因产品,另一类昆虫细胞表达系统则是建立在对果蝇等昆虫细胞进行稳定转化的基础之上的，在稳定性和表达效率方面更为突

29、出。 目前，利用该系统已经成功地生产了鼠单克隆抗体、人鼠嵌合抗体及人单克隆抗体等多种抗体分子，还将抗体分子与尿激酶型纤溶酶原激活物等肿瘤相关蛋白进行了融合表达，这些抗体分子多数能正确组装，完成糖基化过程，具有相当的活性,一以重组杆状病毒为载体的昆虫表达体系,重组杆状病毒表达系统是在真核环境中高效表达外源蛋白的有力工具。 多核多角体病毒是使用最广泛的载体，该亚群的原型为苜蓿银纹夜蛾多核型多角体病毒(AcMNPV)，病毒基因组为共价闭合环状双链DNA，长80200kb,具有完整的感染性，可容纳100kb的外源DNA，能克隆多个外源基因； 不依赖辅助病毒，悬浮培养的昆虫细胞可增殖到很高的滴度； 多数

30、表达的蛋白在昆虫体内能保持可溶状态，有利于大量分离表达蛋白； 在自然界生存短暂，可以保证生物安全； 病毒的专一性，不能感染脊椎动物细胞，其启动子在哺引动物中是失活的，有利于表达肿瘤相关基因及有潜在毒性蛋白,多核多角体病毒作载体的优点,AcMNPV及组内其他成员的特性之一是能在受感染的细胞内形成大量分子量约29kD的多角体蛋白衍生蛋白(PDV)包含体。 PDV可保护胶囊化的病毒避免热和干燥等外部因素的破坏，而当受感染的昆虫死后，大量的PDV可以作为寄主分解物释放出来。 用感染了病毒的饲料饲喂昆虫幼虫时，PDV可在昆虫的中肠溶解，释放病毒颗粒，开始下一轮侵染,尽管多角体蛋白是昆虫体内含量最高的蛋白

31、(约占总细胞总蛋白的3050)，但它并非必需蛋白，可以用外源ORF替代多角体蛋白ORF来构建表达载体。 多数杆状病毒表达载体的构建过程大体如下：将目的基因克隆入合适的转移载体；用重组的转移载体和相应的野生型或改造过的野生型杆状病毒DNA共转染昆虫细胞；用噬菌斑分析分离并鉴定阳性重组体；扩增病毒以进行大规模的蛋白生产；纯化所表达的外源蛋白,二杆状病毒表达系统的效率与加工能力,杆状病毒载体可依据所表达的是包含体还是可溶蛋白来分类，也可依据同时表达的蛋白数量来分类。 与6个组氨酸融合表达的蛋白可以利用柱层析快速纯化，而与信号肽融合的蛋白可以分泌到培养基中进行纯化,多数载体利用的都是晚期启动子P10或

32、polyhedrin，在杆状病毒复制的晚期，绝大多数蛋白的合成都已终止了，仅有P10和polyhedrin启动子仍保持活跃状态，这样就可以自然富集目的蛋白。 就这两种启动子而言，它们在转录和翻译水平上的活性是相互独立的，表达强度也很接近,昆虫表达系统拥有原核表达系统所不具备的加工能力，但使用晚期启动子时，在病毒复制的末期对产物的修饰可能已经发生了变化，所以对产物蛋白的修饰也并非是完全和有效的。 利用病毒前早期启动子来驱动外源基因的表达可以在细胞感染后不久表达目的蛋白，在一定程度上提高糖基化能力，使它能表达更为复杂的糖基结构，但要以表达量降低为代价,尽管在昆虫细胞内可以完成蛋白的糖基化，但作用方

33、式和哺乳动物却有所不同。 昆虫细胞表达的乙肝病毒表面抗原蛋白不具有和从血浆中得到的蛋白一样复杂的糖基结构；即使在昆虫和哺乳动物细胞中有相同的N端糖基化位点，形成的寡糖链也可能不同,昆虫表达系统对蛋白前体的蛋白酶切割能力方面，虽然多数哺乳动物的分泌信号肽可以在昆虫细胞中得到精确处理，但带有信号肽序列却未必能分泌成熟蛋白。 利用不同哺乳动物细胞表达鼠抗人肿瘤坏死因子单链抗体时，不能产生分泌表达，而在昆虫表达系统中则可以分泌表达，这在一定程度上说明，除对信号肽的处理外，其他蛋白酶切割位点的存在数量及昆虫对它们的识别能力都与高等真核生物有差异，这些都是表达活性外源蛋白的制约因素,杆状病毒表达系统每升细

34、胞培养物能够提供500mg甚至700mg重组目的蛋白。昆虫细胞中重组蛋白的表达量在感染的后期可占总蛋白的一半，比大肠杆菌效率要高许多。 外源蛋白的表达还要受诸多因素的影响，高质量的培养基是获得高效表达的前提，昆虫细胞培养要求相对较高的氧浓度以及有高活性且生长在对数期的细胞。 此外，所表达外源基因的特性也会对表达水平产生影响,三其它昆虫表达系统,另一类稳定转化的表达系统是建立在用适当启动子驱动外源基因对昆虫进行稳定转化的基础上。 寄主细胞通常来源于双翅目昆虫，一般是果蝇和蚊子，包括来自果蝇的Schneider2和Kc以及来自白纹伊蚊的C7等细胞系,此外，利用转座子转化昆虫也是一种重要的稳定转化方法。 目前已经借助hermes、hobo、manner、piggyBac等转座子完成了对果蝇、伊蚊等双翅目昆虫的稳定转化，但对鳞翅目昆虫却没有效果。 利用鳞翅目昆虫转座子piggyBac构建的衍生载体成功地对家蚕进行了种系转化，这为鳞翅目昆虫的稳定转化开辟了道路,昆虫表达系统与大肠杆菌表达系统相比，有能对所表达的蛋白进行更为复杂的加工和修饰等许多优点。 比如在表达抗内皮细胞选择蛋白单链抗体时发现该蛋白在果蝇细胞SC2的培养