讲生物技术幻灯片

1、1,第12讲 生物技术,第一节 生物技术概述 第二节 基因工程 第三节 其它生物技术,发光树,2,第一节 生物技术概述,生物技术将主导人类历史的第三次技术革命 第一次技术革命工业革命 解放人的双手 第二次技术革命信息技术 扩展人的大脑 第三次技术革命生物技术 改造生命本身 生物技术的发展为人类带来了巨大的利益和财富，将是未来经济发展的新动力,3,生物工程简史,传统发酵酿酒、制酱、制醋技术 1860年，Pausteur单一霉菌纯粹培养技术 1878年，啤酒酵母单一培养技术 1881年，细菌的纯粹培养技术 1929年，发现抗菌素“盘尼西林” 1946年，用细菌生产出氨基酸 1952年，用微生物转化

2、荷尔蒙获得成功 1953年，Watson和Crick提出了DNA双螺旋结构 1956 年，Kornberg 发现了 DNA 聚合酶 1966 年，破译了氨基酸三联密码子,4,生物工程简史,1970 年，发现了核酸限制性内切酶 1972年，Stanford大学构建了第一个重组DNA分子 1975 年，研制出了第一个单克隆抗体 1982 年，FDA 批准了第一个基因工程药物-重组人 胰岛素 1983 年，Mullis 发明了聚合酶链式反应 (PCR) 技术 1990 年，人类基因组计划(HGP) 启动 1997 年，克隆羊多利诞生 2000 年，人类基因组序列草图完成 2003年，人类基因组计划完

3、成,5,世界上第一个生物技术公司,1976年4月7日，Herb Boyer 和 Bob Swanson 创建了 Genentech 公司，标志着生物技术产业的诞生,6,生物技术,应用自然科学及工程学的原理，依靠微生物、动物、植物体对物料进行加工，以提供产品为社会服务的技术1982年，国际合作与发展组织 以现代生命科学为基础，结合先进的工程技术手段和其他基础学科的科学原理，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需产品或达到某种目的1986年，国家科委,7,现代生物技术,传统生物技术：微生物发酵，一般可分为上游/中游/下游过程 现代生物技术：以DNA重组为主要手段的基因工程为核心，

4、也包括酶工程/细胞工程/发酵工程等；多学科交叉；广泛使用计算机及各种高科技仪器设备；应用领域广泛,8,生物工程,生物工程是生物技术的总称，是对生命有机体在分子水平、细胞水平、组织水平、个体水平进行不同层次的创造性设计和改造，使之能定向组建具有特定性状的新物种或新品系，从而造福人类的现代应用技术。 研究生物工程的意义： 使人类进入了按照自己的需要人工创造新生物的伟大时代。 世界新技术革命的三大支柱之一（信息、材料、生物工程），具有相当大的发展潜力,9,生物工程的内容和特点,生物工程的四大体系： 基因工程 细胞工程 蛋白质工程 发酵工程 生物工程的显著特点： 高技术（精细和密集的复杂技术） 高投入

5、（尤其是前期科研投入高） 高利润,10,第二节 基因工程,基因工程就是将不同生物的外源DNA(基因）插入到载体分子上，形成“杂种”DNA分子，导入受体细胞中扩增和表达，从而得到期望的由这个外源基因所编码的蛋白质。 重组DNA技术，又称为基因或分子克隆技术，是基因工程的核心技术。该技术包括了一系列的分子生物学操作步骤,11,2.1 理论上的三大发现和技术上的三大发明导致了基因工程的诞生,理论上的三大发现： DNA为遗传物质 DNA双螺旋结构的发现和DNA半保留复制机制 遗传密码与中心法则 技术上的三大发明： 限制性内切酶和连接酶 载体 逆转录酶 1973年，完成了DNA的体外重组并成功转化,12

6、,分子生物学基础,DNA即脱氧核糖核酸，携带决定生物遗传，细胞分裂、分化、生长以及蛋白质生物合成等生命信息 DNA分子的基本单位是脱氧核糖核苷酸，由碱基、脱氧核糖和磷酸基三部分组成 碱基有四种：A、G、C、T,13,限制性内切酶DNA的“手术刀,限制性内切酶：生物工程中最重要的工具酶，主要从原核生物中提取；它能识别双链DNA分子中的特异性核苷酸序列，使它在特定的位点水解。 Arber、Smith和Nathans因为在发现限制性内切酶方面的开创性工作而共同获得了1978年的诺贝尔奖 该种酶已经发现和鉴定了200多种,14,EcoRI和T4连接酶,EcoRI特异识别GAATTC,粘性 末端,15,

7、常见限制性内切酶,16,载体运送基因的工具,载体是运送目的基因片段进入宿主细胞的工具，目前最常用的载体包括细菌质粒、噬菌体、cosmid质粒和YAC载体等。 质粒是细菌细胞中自然存在于染色体外可以自主复制的一段环状DNA分子。进入到宿主细胞中的一个质粒可以大量增加其拷贝数,17,细菌质粒pUC18,多克隆 位点,18,2.2 重组DNA的一般操作步骤,1、获得目的基因 2、构建重组DNA分子 3、转化受体细胞 4、筛选和鉴定转化子 5、培养转化细胞获得所需的遗传性状或产物,19,1）获得目的基因,分离,逆转录,从生物基因组中分离,基因组DNA,酶切产物,总RNA,mRNA,cDNA,人工合成,

8、化学合成,PCR,20,细胞内总DNA的提取,21,紫外分光光度计测定DNA溶液的纯度和浓度,22,基因文库的构建,23,反转录人工合成cDNA,24,PCR法同时完成目的基因的寻 找和扩增,PCR的发明是DNA操作技术的革命 美国Mullis教授1988年发明了PCR技术 1993年获得诺贝尔奖,25,2）构建重组DNA分子,外源DNA,质 粒,酶切位点,酶切位点,酶切,酶切,混合,DNA连接酶,26,3）将重组DNA引入宿主细胞,转化：某一基因型细胞从周围介质中吸收另一基因型细胞的DNA，而使其基因型和表型发生相应变化的现象。 转染：除去蛋白质外壳的病毒核酸感染细胞或原生质体的过程。 转导

9、：用噬菌体做载体，将一个细胞的基因传递给另一个细胞的过程,27,基因枪法,28,显微注射,29,农杆菌介导,30,4）对转化子的筛选,筛选：从大量携带重组体DNA的宿主细胞中分离出携带目的基因的细胞。 筛选方法： 遗传学方法对于带有抗药性基因的质粒，可通过检测受体菌是否由敏感状态变成抗药状态进行筛选. 免疫学方法用特异性抗体检测基因产物从而筛选阳性克隆的方法,31,Southern杂交转化子的分析,32,将老鼠的基因转到大肠杆菌中,抽取DNA,切下鼠DNA,切开质粒DNA,将质粒导入宿主细胞,混合、连接,33,将老鼠的基因转到大肠杆菌中,培养基中加抗生素,培养,裂解细胞释放DNA,分子杂交,分

10、离扩增目的克隆,34,2.3 基因工程应用,基因工程在医学上被用于大量生产过去难以得到或几乎不可能得到的蛋白质肽类药物,10g胰岛素,1000 磅牛胰,200升发酵液,干扰素,1200升人血,1升发酵液,23万美元/病人,200300美元/病人,35,基因工程技术提高奶酪产量,哺乳小牛,胃,凝乳酶,凝乳酶基因,啤酒酵母,转入,制造奶酪,36,转基因农作物,转基因植物获得新的性状,37,2002年全球转基因作物种植情况,38,转基因动物,转基因动物首先在小鼠获得成功。现在转基因动物技术已用于牛、羊，使得从 牛/羊 奶中可以生产蛋白质药物。称为“乳腺反应器”工程。 例如：从转基因羊的羊奶中提取出治

11、疗心脏病的药物tPA,39,蜘蛛山羊,转基因山羊能通过乳腺分泌产生有着超强抗张强度的蜘蛛丝，很多科学家把蜘蛛丝叫做“生物钢,40,环境工程菌,美国 GE 公司构造成功具有巨大烃类分解能力的工程菌，并获专利，用于清除石油污染,41,研究人类远古的遗传信息,42,第三节 其它生物技术,3.1 细胞工程：是指通过细胞水平上的筛选或改造，获得有商业价值的细胞株或细胞系，再通过规模培养，获得特殊商品的技术与过程。 基本原理：将一种生物细胞中携带全套遗传信息的基因组或染色体全部转入另一种生物细胞，从而改变细胞的遗传性，改造生物的性状和功能。 包括细胞融合、细胞器移植、染色体工程、细胞和组培技术等,43,动

12、物细胞培养,44,体细胞杂交/细胞融合技术,体细胞杂交/细胞融合技术：通过生物学、化学或物理学的方法，使两个不同种类的体细胞融合在一起，从而产生具有两个亲本遗传性状的新细胞。 例如：童鱼世界上第一条没有父母的鱼 ，“鲫鲤核质杂交鱼,45,利用杂交瘤细胞制备单克隆抗体,46,克隆“多莉羊”细胞融合技术的高峰,47,3.2 蛋白质工程,后基因组时代”将是“蛋白质组学时代”，即从对基因信息的研究转向对蛋白质信息的研究，包括研究蛋白质结构、功能与应用及蛋白质相互关系和作用。 蛋白质工程就是在对蛋白质的化学、晶体学、动力学等结构与功能认识的基础上，对蛋白质人工改造与合成，最终获得商业化的产品,48,蛋白

13、质工程的一般过程,从生物体中分离纯化目的蛋白 测定其氨基酸序列 借助核磁共振和X射线晶体衍射等手段，尽可能地了解蛋白质的二维重组和三维晶体结构 设计各种处理条件，了解蛋白质的结构变化，包括折叠与去折叠等对其活性与功能的影响 设计编码该蛋白的基因改造方案，如点突变 分离、纯化新蛋白，功能检测后投入实际使用,49,酶催化反应动力学,50,通过点突变改造蛋白质的结构,51,蛋白质复性,将蛋白质从结构不规则、无活性的状态，恢复到有唯一立体结构、有生物活性的状态的过程称为蛋白质复性,52,大肠杆菌表达系统,效率高、产量大 周期短、成本低 工艺稳定、质量可控 缺点是易形成包含体。因无法有效的解决复性问题，

14、在美国每年造成的经济损失就达十亿美元,53,原核与真核细胞表达系统比较,原核细胞: 发酵包含体复性 纯化目的蛋白 真核细胞: 发酵 上清液纯化目的蛋白,54,3.3 发酵工程,发酵工程是利用微生物的特性，通过现代工程技术，生产有用物质或直接将其应用于工业化生产的一门技术。 发酵工程的基本步骤：包括菌种选育、菌种生产、代谢产物发酵和分离以及微生物机能的利用等。 优点：投资省；见效快；污染小 发酵工程应用广泛：医药工业；食品工业；能源工业；饲料工业；冶金工业；农业,55,发酵工业回顾,几千年前，人类开始酿酒、制酱、制奶酪等 1675年，列文虎克发明了显微镜，观察到了微生物 巴斯德证明酒精发酵是由于

15、酵母菌引起的，发酵现象是由微生物所进行的化学反应 柯赫建立了单种微生物的分离和纯培养技术，新的发酵产品不断出现，以固态发酵和浅层液态发酵为主 上世纪40年代，抗生素大规模深层发酵工艺建立 随着新型发酵设备、发酵工艺和育种技术的发展，现代发酵工程达到了一个新的高度,56,发酵工程的内容,发酵工程由三部分组成：上游工程、发酵工程和下游工程 上游工程包括优良菌种的选育、最适发酵条件（pH、温度、溶氧和营养组成）的确定、营养物的准备等 发酵工程主要指在最适发酵条件下，在发酵罐中大量培养细胞和生产代谢产物的工艺技术。要求严格的无菌生长环境。可分为分批发酵，补料分批发酵和连续发酵 下游工程指从发酵液中分离

16、和纯化产品的技术。包括固液分离技术，细胞破壁技术，蛋白质纯化技术，和产品的包装处理技术。还要考虑发酵后的菌体与废物处理问题,57,发酵工艺组成部分,培养基制备 种子培养发酵罐产物的提取精制 无菌空气,58,菌种选育,发酵工业的生产水平取决于三个要素：生产菌种、发酵工艺和设备 菌种选育的目的是为了改良菌种的特性，使其符合工业生产的需要 提高其生产能力 能适应特定的工艺条件，如能利用廉价的原料、耐受性好 目前主要采用自然选育和诱变育种的方法，工作量大，有一定盲目性 基因工程、细胞工程等育种方法具有定向性,59,发酵的基本过程,60,初级代谢产物和次级代谢产物的比较,61,发酵生物反应器,发酵罐是最重要的微生物细胞反应器 染菌率低 大型化，有利于提高经济效益 过程优化可提高产量和降低成本 利于提高产品回收率和质量 生物反应器的基本类型 搅拌式生物反应器（stirred tank reactor） 鼓泡塔式反应器（bubble column） 气升式反应器（airlift reactor,62,几种常见的生物反应器,63,发酵罐的结构,64,发酵过程监测,物理参数 温度、压力、流量、转速、粘度、泡沫位等 化学参数 pH、溶氧、尾气、发酵液成分、离子浓度等 生物参数 生物量