药学科学分析化学药物分析学药物分析学生物体1.ppt

1、a,1,药学科学 分析化学 药物分析学 药物分析学 生物体内药物分析 生物体内药物分析,前 言,a,2,原料药 （杂质干扰）,仪器方法 痕量 快速 灵敏 准确 精密 常量 化学方法,(动态、活体) 难 度 递 增 (静态),a,3,体内药物分析,体内药物分析基本概念 生物样品的种类与采集 生物样品分析的前处理 体内药物分析方法验证 体内药物分析应用示例,Biopharmaceutical analysis,a,4,体内药物分析（Biopharmaceutical Analysis; Biomedical Analysis）是随着临床药理学、生物药剂学和生物医学等学科的发展和需要而建立起来的一门

2、药物分析学的分支学科，是一门研究生物机体中药物及其代谢物和内源性物质的量变与质变规律的分析方法学。,体内药物分析的性质,体内药物分析基本概念,a,5,通过现代分析技术的各种手段，了解药物进入体内后在数量与质量上的变化，获得药物动力学特征、药物相互作用规律、体内生物转化与代谢途径等动态信息； 探索涉及药物体内分析的新技术和新方法； 为新药研制、药品生产和临床应用等方面的研究提供必要的实验研究手段、作出科学的估计与评价。,a,6,体内药物分析Biopharmaceutical AnalysisBiomedical Analysis,生物药物分析体液药物分析,药物进入体内,量变,质变,a,7,1.

3、研究药物体内过程的重要性 2. 与新药研究、临床合理用药、药物 滥用、兴奋剂检测等密切相关,体内药物分析的意义,体内药物分析基本概念,a,8,示例：水杨酸血药浓度与疗效毒性关系 药理作用 有效血药浓度（g/ml） 镇痛 50100 抗风湿 250 抗炎 350400 中毒 550 致死 16001800,a,9,兴奋剂检测 Doping control,琼斯承认服用兴奋剂类固醇THG； 尿样检查,Tetrahydrogestrinone，学名为“四氢乙基羟基二降孕三烯炔酮”。,a,10,1. 体内药物分析方法的研究 进行生物样品预处理(pretreatment)方法、分离分析实验条件的优化选择

4、，考察体内分析方法的灵敏度、专属性、准确度、线性范围等，为临床药理学、临床药学等相关学科提供专一、灵敏、准确、快速、简便的体内药物分析方法。,体内药物分析的任务,体内药物分析基本概念,a,11,2. 在临床治疗药物监测（Therapeutic Drug Monitoring，TDM）中的应用 治疗药物监测即测定血液中或其它体液中药物浓度，观察临床药物反应，考察药物治疗效果，必要时根据药动学原理调整给药方案; 方向是实现个体化给药，目的为临床合理用药服务，达到最佳的药物治疗效果。,a,12,治疗药物监测,治疗药物监测对体内分析方法有特殊要求： 即分析方法快速、简便、准确，且血药浓度一般 只需测定

5、特定时间的一次数值; 常见方法有免疫学、光谱学和色谱学方法。,a,13,列为治疗监测药物的一般原则： （1）有效血药浓度范围较窄、剂量小、毒性大的药物。 如地高辛、奎尼丁、庆大霉素等。 （2）药代动力学个体差异大、药理作用强、且难于通过剂量来控制的药物，如三环类抗抑郁药、苯妥英等。 （3）病理状态（如胃肠道疾病影响药物的吸收、肝脏疾病影响药物的代谢、肾脏疾病影响药物的排泄），对某些药物进行血药浓度监测。 （4）药物的毒副反应与疾病本身症状相似，如地高辛房颤毒性反应，监测血药浓度，增减剂量。,a,14,3.在药代动力学(Pharmacokinetics)研究中的应用 药代动力学研究涉及药物在体内

6、的吸收、分布、代谢与排泄等动态过程，需要研究血药浓度时间曲线的变化，探讨药物分布与药理作用的关系; 其中生物样品中药物浓度高低差别大，且常需同时测定药物及其代谢产物，因此要求体内分析方法必须具有足够灵敏度和专属性。,a,15,示例：单剂量口服格拉司琼片后人体相对生物利用度研究 本品是一强效、高选择性的外周神经元和中枢神经系统内5-HT3受体拮抗剂。对因化疗、放疗及手术引起的恶心和呕吐具有良好的预防和治疗作用。化疗、放疗及外科手术等因素可引起肠嗜铬细胞释放5-HT， 5-HT可激活中枢或迷走神经的5-HT3受体，触发呕吐反射。本品可选择性地阻断这一反射的触发。由于本品的高选择性作用，因而不具有其

7、他止吐药的副作用。,a,16,色谱条件 色谱柱：Lichropspher C18柱，50mm4.6mm5m； 流动相：乙腈-10MM乙酸铵（0.5%乙酸）=40:60 流速：1.0ml/min，进样量 20l,质谱条件 ESI离子源，正离子模式检测； 毛细管电压：30V 干燥气 ：氮气 380；碰撞气：氩气 MRM方式检测：格拉司琼 m/z 313.4138；内标 m/z 270201 CE电压：16eV（格拉司琼）和10eV（内标）,a,17,格拉司琼,内标,待测样品和内标的典型质谱图,a,18,血样处理 取血浆100l , 置于1.5ml EP管中，加入50 l 氢氧化钠碱化，混匀后加入1

8、 ml乙酸乙酯涡旋2 min 液液萃取，于3500 rpm离心10 min，取上清液0.8ml 于40 水浴下通氮吹干，残留物以50 l 流动相溶解,取上清液20 l进样分析。 体内分析方法学评价 线性范围：0.0220.00 ng.ml-1 最低检测限：0.02 ng.ml-1 方法回收率： 97% 基质效应：127%133% 日内日间标准差：8.4%。,a,19,空白血浆,标准添加血浆,实测血浆,a,20,受试制剂和参比制剂药代动力学曲线,a,21,格拉司琼片相对生物利用度,a,22,4.在生物体内内源性物质测定中的应用 体内内源性物质如氨基酸、激素、儿茶酚胺、肌酐、草酸、尿酸等 机体正常

9、生理条件或机体发生病变 测定体内内源性物质或疾病标志物的含量 疾病的辅助诊断或及早预防。 兴奋剂检测：睾酮/表睾酮；去氢表雄酮 促红细胞生成素EPO,a,23,示例：尿液中多胺的气相色谱-质谱法测定 多胺包括腐胺（putrescine，Put）、精脒（spetrmidine， Spd）、精胺（spermine，Spm）和尸胺（cadaverine，Cad）。体液中多胺含量的增加，预示着某部分组织生长迅速，或者因恶性肿瘤而促成多胺的增加。因此，测定体液中多胺的含量可以作为临床生化诊断恶性肿瘤的辅助方法。 （1）色谱条件 HP-5（0.2mm25m）毛细管柱，毛细管初始柱温为110，以20min-

10、1升温至280。气化室温度230，接口温度280。以氦气为载气，流速0.8 mlmin-1，无分流进样，分流阀切换时间0.8 min。电离方式：电子轰击（EI），能量70eV，倍增电压2000V。选择离子检测（SIM）：1，3-丙二胺226、254，腐胺（Put）226、267，精脒（Spd）226、254、536，精胺（Spm）226、254，尸胺（Cad）226，内标1，6己二胺226、254。,a,24,（2）尿样处理 收集24小时尿样，加盐酸防腐，记总量，取5ml于-20冰箱保存待测。取尿样0.3ml,经酸化水解、碱液中和、树脂纯化，70吹干，残留物加乙酸乙酯100l、七氟丁酸酐25l

11、，封口后70反应30分钟。反应液中和后经正己烷二氯甲烷（4：1）提取，有机层分离挥干，残留物以50l乙酸丁酯溶解,取1.0l进样。,a,25,（3）体内分析方法学评价 线性范围：20500 ng 线性相关性：r 0.99 回收率： 75% 日内日间标准差：8.0%。 （4）尿样分析 30例正常人尿液中多胺含量统计结果（nmol/24h） 1，3丙二醇 腐胺 尸胺 精脒 精胺 男性（n=15） 6.074.05 39.3713.95 9.798.81 （21-48岁） 女性（n=15） 4.453.37 28.938.85 11.4510.86 （18-60岁） ,a,26,体内药物分析的特点

12、常规药物分析：原料药物和药物制剂分析 真伪鉴别、纯度检查、含量测定 共存杂质、制剂辅料、复方药物 体内药物分析：复杂生物样品的微量分析 药物浓度低 样品采量少 干扰成分多,体内药物分析基本概念,a,27,体内药物分析的特点,1、生物样品中药物浓度低，浓度波动范围大，对分析方法灵敏度、线性范围要求高； 2、可供分析测定的样品量一般较少，不易重新获得，且具有易变化性，应选择合适方法储存并尽快分离检测； 3、生物样品中干扰杂质多，分析测定前一般需经过分离、纯化处理；,体内药物分析基本概念,a,28,4、选择进行体内分析的方法，在保证一定灵敏度的前提下，要求简便、快速，以便迅速为临床用药及中毒解救提供

13、参考。 5、必须配备一定的仪器设备，包括样品冷藏、萃取、浓集等辅助设备以及高灵敏度、高专属性的分析检测仪器。 6、生物样品分析工作量相对较大，检测的实验数据处理和阐明有时比较困难，需要相关学科的合作和参与。,a,29,生物样品的种类与采集 体内药物分析研究药物在体内的“命运（fate）”即药物的吸收、分布、代谢和排泄。因此，凡是体内药物到达之处，如体液、器官、组织和排泄物等均是体内药物分析的研究对象。,a,30,具体考虑体内药物分析的研究对象即生物体内样品，则需要从生物样品来源、样品种类和检测组分三方面来讨论。 1. 生物样品来源：决定于研究的目的 人体与动物 2. 生物样品种类：如体液、器官

14、、组织和排泄物等 3. 检测组分：即生物样品中的药物及其代谢物等,a,31,生物样品来源,临床前 吸收试验 组织分布试验 代谢 排泄 毒代动力学 临床 临床药代动力学 制剂生物利用度及生物等效性,生物样品的种类与采集,a,32,生物样品种类选取的一般原则： （1）必须是能够反映出浓度与药物效应之间关系； （2）易于获得； （3）便于处理，适合于分析； （4）根据不同目的与要求进行选取。,生物样品的种类与采集,a,33,均匀生物样品： 血液（血浆、血清、全血）、尿液、唾液、胆汁、乳汁、脑脊液、淋巴液、汗液和性腺分泌液等体液、呼出气体 非均匀生物样品： 心、肝、肾、脾、肺、脑、胃、肠、子宫或睾丸、

15、脂肪、肌肉、皮肤等器官、组织、粪便排泄物,生物样品种类,生物样品的种类与采集,a,34,血液,自然凝结,加抗凝剂,离心,离心,全血,上层：血清（比血浆少纤维 蛋白原）（40%）,下层：血细胞（凝块）,上层：血浆 （50%）,下层：血细胞,示图全血、血浆和血清之间的关系及其制备,血样Blood,a,35,血浆plasma/血清serum： 直接与组织液接触并达到平衡，直接反映作用部位药浓变化，血浆的使用频率高于血清; 全血： 血浆/血清中的药物浓度 + 血细胞(贮存库，一般无药理作用）中的药物浓度。,a,36,特点1：尿药浓度通常变化较大； 特点2：尿药大多呈结合状态； 优点1：易得，且样品量多

16、； 优点2：正常尿液仅含微量蛋白； 缺点1：尿液是一种良好的细菌培养基； 缺点2：尿液中多具有紫外吸收的化合物。,尿样Urine,a,37,优点1：非伤害性采样，且不受时间地 点限制； 缺点1：唾液药浓一般低于血浆药浓； 缺点2：某些药物的唾液药浓（S）与血浆游离药浓（UP）十分接近，但两者相关系数不明确； 缺点3：pH改变会影响弱酸性和弱碱性药物在唾液中的药浓,唾液Saliva,a,38,S：唾液药浓，P：血浆药浓，UP：血浆游离药浓,表1一些药物的S/P值与S/UP值,a,39,表2药物随唾液pH变化的类型,a,40,检测组分：即生物样品中的药物及其代谢物等 （1）原形药物的测定； （2）

17、游离药物的监测； （3）活性代谢产物的监测； （4）药物对映体的监测； （5）作用部位药物浓度的测定； （6）体内内源性物质的测定。,生物样品的种类与采集,a,41,a,42,体内药物分析方法学研究,血样 尿液 唾液 胆汁 组织器官,前处理方法 分离 纯化 浓集,样品测定 方法建立 方法优化,方法学研究 灵敏度 准确度 精密度 线性和范围 耐用性 ,灵敏、准确、快速、简便,生物样品分析的前处理,a,43,分析过程中的时间消耗分布,生物样品分析的前处理,a,44,生物样品的处理一般原则,生物样品贮存 生物样品均匀化 结合物水解 生物基质的性质 测定对象的性质,a,45,生物样品的贮存 采集哪种生

18、物样品：血浆、血清、全血、尿、组织 血浆酯酶引起的水解血浆样品加入酯酶抑制剂 微生物导致的腐败尿液样品加入防腐剂冷藏 储存条件 20：大部分药物 80：阿莫西林等抗生素 加稳定剂：卡托普利等 立即测试：维生素C等,生物样品分析的前处理,a,46,生物样品均匀化 体液样品：尿液、血浆涡旋混匀 固体样品：组织、粪便加入适量溶剂进行高速匀浆,生物样品分析的前处理,a,47,结合物水解 相代谢产物如葡萄糖醛酸结合物、硫酸酯类结合物 极性大、亲水性、不易于提取富集 酸水解：简便、快速，不具备专一性，注意药物是否被破坏 酶水解：-葡萄糖苷酶、硫酸酯酶，专一性强，时间长，实验费用高,生物样品分析的前处理,a

19、,48,酸水解 无机酸，通常用盐酸。使用：酸浓度、酸化时间、是否加热等因药物而异，需实验确定。 酶水解 常用的水解酶是-葡萄糖苷酶、硫酸酯酶，或两者混合物。使用：控制pH（4.5-7.0），厌氧温育16小时 与酸水解相比：酶水解温和、专属性强，一般不会引起药物分解；但试剂较贵、耗时长、引入黏液蛋白等杂质，可能导致乳化或堵塞,生物样品分析的前处理,a,49,前处理的目的： 去蛋白，释放药物 样品纯化和富集 满足分析方法灵敏度的需要 防止分析仪器的污染和劣化 满足大量样品分析的需要 微量、快速,生物样品分析的前处理,a,50,(碱性药物),全血/血浆/组织,(1)蛋白沉淀 (2)调节pH,选择性溶

20、剂提取,净化,残渣,碱回提物,酸回提物,(酸性药物),衍生物,化学衍生化(提取烃基化),RIA,HPLC,UV/荧光/电化学,滤液,NP,RP,原型药物,衍生物,GC,TLC,(FID/ECD/NPD/MS),(光密度法检测或洗提后其它法分析),示图样品处理步骤与分析方法的选择,生物样品分析的前处理,a,51,生物样品前处理方法,常用的生物样品预处理方法 沉淀蛋白 液液萃取 液固提取 ,a,52,生物样品分析的前处理,沉淀蛋白 操作： 50l血浆150 l甲醇涡旋1min3500rpm离心10min取上清液进样分析 常用沉淀剂： 与水能混溶的有机溶剂甲醇、乙腈 酸性沉淀剂三氯醋酸、高氯酸 ,a

21、,53,应用中注意问题： 去蛋白后的上清直接进样对色谱分离及色谱柱和仪器的影响 色谱峰形 液质联用分析中的基质效应 检测灵敏度是否足够,生物样品分析的前处理,a,54,a,55,常用蛋白沉淀剂的用量及沉淀蛋白的百分率,*：样品浑浊，妨碍准确测定,a,56,示例 血浆样品中虎杖苷前处理方法,A：虎杖苷标准对照品 由海王集团技术中心天然药物室提供 3，4，5-三羟基芪-3-D-葡萄糖苷 Mr390 B：二苯乙烯苷化学对照品 由中国药品生物制品检定所提供 2，3，5，4-四羟基二苯乙烯-D-葡萄糖苷 Mr406,a,57,SD大鼠血浆样品：乙腈沉淀蛋白；操作简便快速，适用于大量样品；存在色谱柱污染和不可逆堵塞 色谱柱：DiamonsilTM C18（5m ，2004.6mm），Supelco保护柱 流动相：甲醇-水（3565），流速：1.0ml/min 紫外检测波长：290nm(0.0005aufs) 柱温：251 J Pharm Biomed Anal,41(2006):240-245 IF2009 2.453,蛋白沉淀 SD大鼠血浆,a,58,示例：人血浆中福多司坦的高通量分析,福多司坦,内标,色谱柱：50mm4.6m