实验四PCR及电泳技术

1、实验4 PCR及电泳技术,1. PCR的基本原理,PCR基本原理 类似于DNA的体内复制。在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。 PCR的基本步聚 1、变性 (Denaturation) ：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA 。 2、退火 (Annealing) ：当温度突然降低时，反应体系中引物和其互补的DNA模板在局部形成杂交链。 3、延伸 (Extension )：在DNA聚合酶和4种脱氧核苷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)及Mg2+存在条件下，53的聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应。 这种热变性-复性-

2、延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复,PCR Cycle - Step 1 - Denaturation Template DNA by Heat (95,Target Sequence,Target Sequence,PCR原理示意图,模板DNA的变性：模板DNA经加热至93左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备,ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC,TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG,ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC,

3、TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG,加热94,引物酶,模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合,PCR Cycle - Step 2 Temperature is lowered (Tm ) and primers anneal to target sequences,Target Sequence,Target Sequence,Primer 1,Primer 2,5,3,5,5,3,5,3,3,引物酶,3,5,3,5,TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG,引物,ATCGCGA

4、TAGCGTAGCTGCGACCTAGC,引物,3,5,5,3,PCR Cycle - Step 3 - At 72 Taq DNA polymerase catalyses primer extension as complementary nucleotides are incorporated,Target Sequence,Target Sequence,Primer 1,Primer 2,5,3,5,5,3,5,3,3,Taq DNA Polymerase,引物的延伸：DNA模板-引物结合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理

5、，合成一条新的与模板DNA 链,3,5,3,5,TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG,ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC,ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC,DNA 聚合酶,TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG,DNA 聚合酶,5,5,3,3,引物,引物,End of the 1st PCR Cycle Results in two copies of target sequence,Target Sequence,Target Sequence,每完成一个循环需2-4 min， 2-3 h就能将待扩目的基因扩增放大几

6、百万倍,3,5,3,5,TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG,ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC,ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC,TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG,5,5,3,3,Target Amplification,No. ofNo. Amplicon CyclesCopies of Target 12 24 38 416 532 664 201,048,576 301,073,741,824,1 cycle = 2 Amplicon,2 cycle = 4 Amplicon,3 cycle = 8 Am

7、plicon,4 cycle = 16 Amplicon,5 cycle = 32 Amplicon,6 cycle = 64 Amplicon,7 cycle = 128 Amplicon,PCR仪,PCR仪,PCR仪,1、PCR反应成分,1）模板 单、双链DNA或RNA都可以作为PCR的样品。若起始材料是RNA，须先通过逆转录得到第一条cDNA。 一般100ng DNA模板/100l。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。最好做浓度梯度对照从而确定最佳条件,PCR反应体系,模板 引物 Taq DNA聚合酶 4种dNTP混合物 Mg2+ 10缓冲液,2）引物 （1）浓度 0.1-0.5 M

8、浓度过高易导致模板与引物错配，反应特异性下降,引物是PCR特异性反应的关键； PCR产物的特异性取决于引物与模板脱氧核糖核酸互补的程度； 人工合成的寡聚核苷酸引物需经离子交换HPLC进行纯化,3）Taq DNA聚合酶 一般0.5-2.5 U/50l； 酶量过少影响反应产量；浓度过高可引起会造成杂带、特异产物带不清晰等不好的结果，浓度过低则得不到所需的产物。最可靠的做法是先做浓度对照,再根据结果决定最佳条件,4）dNTP (dATP、dCTP、dGTP、dTTP 4） dNTP浓度取决于扩增片段的长度; 四种dNTP浓度应相等; PCR常用的浓度为50-200M，不能低于10-15M。 浓度过高

9、会抑制Taq 酶的活性，易产生错误碱基的 掺入，浓度过低则降低反应产量,5）10PCR缓冲液 (Mg2+)： 500 mM KCl， 100 mM Tris-HCl (pH 8.4)， 150 mM MgCl2 ， 1 mg/ml明胶,PCR反应体系： 10PCR buffer 2.5l dNTP mix 各0.5l 引物1 0.5 l 引物2 0.5 l DNA模板 2 l Taq 酶 0.5 l 加双蒸水至总体积为25l,PCR扩增程序,94, 300S 94, 60S 55, 60S 72, 60S 72, 7min,30 循环,2. 电泳技术,电泳槽,制胶板,梳子,电源,电泳仪,提供稳

10、定的电压或电流,电极缓冲液和凝胶的容器,形成点样孔,制备垂直或水平凝胶,电泳分离的原理,电泳(electrophoresis)溶液中带电粒子(离子)在电场中移动的现象。 1、电荷效应 利用带电粒子在电场中移动速度不同而达到分离的目的。 2、分子筛效应 不同的分离介质形成的孔径不同，在孔径大的介质中泳动速度快，相反则慢。 3、待分离生物大分子的性质 一般来说，分子带的电荷量越大、直径越小、形状越接近球形，则其电泳迁移速度越快。 4、电场强度 电场强度（V/cm）是每厘米的电位降，也称电位梯度。电场强度越大，电泳速度越快,电泳技术的种类,按支持介质的不同可分为： 纸电泳(Paper electrophorisis) 醋酸纤维薄膜电泳(Cellulose Acetate electrophoresis) 琼脂凝胶电泳(Agar Gel electrophoresis) 聚丙烯酰胺凝胶电泳(Polyacrylamide Gel electrophoresis) (PAGE) SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE,琼脂糖凝胶电泳,对于双链DNA，电泳迁移率的大小主要与DNA分子大小有关,1、熔化琼脂糖时，宜低火，防暴沸； 2、倒胶时温度要低于60且速度要慢； 3、拔梳子和点样要小心，