3代谢的人工控制及其在发酵工业中的应用

1、4.3,代谢的人工控制及其在发酵工业中的应用,工业发酵的目的：大量积累人们所需要的微生物代谢产物,代谢的人工控制：人为地打破微生物的代谢控制体系，使代谢,朝着人们希望的方向进行,人工控制代谢的手段,改变微生物遗传特性,遗传学方法,控制发酵条件（生物化学方法,改变细胞膜透性,工业发酵的目的,大量地积累人们所需要的微生物代谢产物,在正常生理条件下,微生物通过其代谢调节系统吸收利用营养物质用于合,成细胞结构，进行生长和繁殖，它们通常不浪费原料和,能量，也不积累中间代谢产物,代谢的人工控制,人为地打破微生物的代谢控制体系，就有可能使代谢朝,着人们希望的方向进行,4.3.1,遗传学方法,4.3.1.1,

2、营养缺陷型菌株的应用,1,对于直线式代谢途径：选育营养缺,陷性突变株只能积累中间代谢产物,A,a,B,b,C,c,D,d,E,末端产物,E,对生长乃是必需的，所以，应在培养基中限量供给,E,使之足以维持菌株生长，但又不至于造成反馈调节（阻遏或抑制,这样才能有利于菌株积累中间产物,C,2,分支代谢途径：情况较复杂，可利,用营养缺陷性克服协同或累加反馈抑制,积累末端产物，亦可利用双重缺陷发酵,生产中间产物,E,A B C,D,F,G,要根据其不同反馈控制机制,各图成立的条件,1,限量添加,E,2,限量添加,E,3,限量添加,E,和,G,4,限量添加,E,和,G,5,限量添加,I,表示营养缺陷突变位

3、置；“”表示反馈调节解除,谷氨酸棒杆菌的代谢调节与赖氨酸生产,E,表示反馈抑制,R,表示反馈阻遏,天冬氨酸激酶,AK,高丝氨酸脱氢酶,HSDH,赖氨酸生产菌,高丝氨酸缺陷型,分支途径,赖氨酸发酵,谷氨酸棒杆菌的,Hom,调控理论的实践应用,分支途径,肌苷酸发酵,IMP,合成途径的代谢调控,4.3.1.2,抗反馈控制突变株的应用,抗反馈控制突变株,是指对反馈抑制不敏感或对,阻遏有抗性，或两者兼有之的菌株,抗反馈控制突变株可以从终产物结构类似物抗性突,变株和营养缺陷性回复突变株中获得,获得方法及其原理,目标产物,赖氨酸,苏氨酸,异亮氨酸,精氨酸,结构类似物,S,2,氨基乙基,L,半,胱氨酸,(AE

4、C,氨基,羟基戊酸,AHV,乙硫氨酸,D,精氨酸,苯丙氨酸,对氟苯丙氨酸,营养缺陷型回复突变株,调节酶的变构特性是由其结构基因决定的，如果调节,酶的基因发生突变而失活，则有两种可能性,一是催化亚基和调节亚基的基因均发生突变,另一种可能仅仅是催化亚基发生突变,如果前者发生回复突变，则又有两种可能性,一是催化亚基和调节亚基恢复到第一次突变前的活性水平,另一种是催化亚基得以恢复，而调节亚基丧失了调节的功能,营养缺陷型回复突变,4.3.1.3,选育组成型突变株和超产突,变株,如果调节基因发生突变，以至产生无效的阻遏物而,不能和操纵基因结合，或操纵基因突变，从而造成,结构基因不受控制的转录，酶,的生成将

5、不再需要诱,导剂或不再被末端产物或分解代谢物阻遏，这样的,突变株称为,组成型突变株。少数情况下，组成型突,变株可产生大量的、比亲本高的多的酶，这种突变,株称为超产突变株,组成型突变株,调节基因发生突变,产生无效的阻遏物而不,能与操纵基因结合,操纵基因突变,突变操纵基因不,能与阻遏物结合,结构基因不受控制地转录，酶的,生成将不再需要诱导剂或不再被,末端产物或分解代谢物阻遏,组成型突变,4.3.2,生物化学方法,1,添加前体绕过反馈控制点：亦能使某种代谢产物大量产生,D,A B C,E F,2,添加诱导剂：从提高诱导酶合成量来说，最好的诱导剂往往,不是该酶的底物，而是底物的衍生物,3,发酵与分离过

6、程耦合,4,控制发酵的培养基成分,4.3.2,控制细胞膜渗透性,使胞内的代谢产物迅速渗漏出去,解除末端产物的反馈抑制,1,用生理学手段,直接抑制膜的合成或使膜受缺损,如,在,Glu,发酵中把生物素浓度控制在亚适量可大量分泌,Glu,控制生物素的含量可改变细胞膜的成分，进而改变膜透性,当培养液中生物素含量较高时采用适量添加青霉素的方法,再如：产氨短杆菌的核苷酸发酵中控制因素是,Mn,2,Mn,2,的,作用与生物素相似,2,利用膜缺损突变株,油酸缺陷型、甘油缺陷型,如,用谷氨酸生产菌的油酸缺陷型，培养过程中，有限制地添,加油酸，合成有缺损的膜，使细胞膜发生渗漏而提高谷氨酸,产量,甘油缺陷型菌株的细

7、胞膜中磷脂含量比野生型菌株低，易造,成谷氨酸大量渗漏。应用甘油缺陷型菌株，就是在生物素或,油酸过量的情况下，也可以获得大量谷氨酸,控制细胞膜的通透性,生物素是脂肪酸生物合成中乙酰,CoA,羧化酶的辅,基，该酶催化乙酰,CoA,的羧化生成丙二酸单酰,CoA,进而合成细胞膜磷脂的主要成分脂肪酸,只要控制生物素的含量就可以改变细胞膜的成分,进而改变膜的通透性，影响到代谢产物的分泌,油酸缺陷型菌株,添加适量的青霉素,甘油缺陷型菌株,5,微生物次级代谢与次级代谢产物,5.1,次级代谢与次级代谢产物,初级代谢,一类与生物生存有关的、涉及到产能代谢和耗能代谢,的代谢类型，普遍存在于一切生物中,微生物从外界吸

8、收各种营养物质，通过分解代谢和合成代谢,生成维持生命活动,所必需,的物质和能量的过程，称为初级代谢,次级代谢,某些生物为了避免在初级代谢过程某种中间产物积累,所造成的不利作用而产生的一类有利于生存的代谢类,型。可以认为是某些生物在一定条件下通过突变获得,的一种适应生存的方式,通过次级代谢合成的产物通常称为次级代谢产物，大,多是分子结构比较复杂的化合物。根据其作用，可将,其分为抗生素、激素、生物碱、毒素及维生素等类型,初级代谢与初级代谢的关系,1,存在范围及产物类型不同,初级代谢系统、代谢途径和初级代谢产物在各类生物中基本相同,它是一类普遍存在于各类生物中的一种基本代谢类型,象病毒这类非细胞生物

9、虽然不具备完整的初级代谢系统，但它们,仍具有部分的初级代谢系统和具有利用宿主代谢系统完成本身的,初级代谢过程的能力,次级代谢只存在于某些生物（如植物和某些微生物）中，并且,代谢途径和代谢产物因生物不同而不同，就是同种生物也会由,于培养条件不同而产生不同的次级代谢产物,不同的微生物可产生不同的初级代谢产物,例如某些青霉、芽孢杆菌和黑曲霉在一定的条件下可以分别合成,8,M,的锌离子的,Czapek,Penicillium urticae,在含有,0.5,10,青霉素、杆菌肽和柠檬酸等次级代谢产物,Dox,培,产黄青霉在在,Raulin,中培养时可以合成青霉酸。但在,Czapek,灰黄青素在,Cza

10、pek,Dox,培养基上培养时可以合成灰黄霉素,养基里培养时合成的主要次级代谢产物是,6,氨基水杨酸，但在含,相同的微生物在不同条件下产生不同的初级代谢产物,Dox,中培养则不产青霉酸,在,Raulin,fulvic acid,0.5,10,6,培养基上培养时则合成褐菌素,M,的锌离子的,Czapek,Dox,培养基里培养时不合成,6,氨,次级代谢产物虽然也是从少数几种初级代谢过程中产生的中间体,用于青霉菌的二种培养基,基水杨酸，但可以合成大量的龙胆醇、甲基醌醇和棒曲霉素,或代谢产物衍生而来，但它的骨架碳原子的数量和排列上的微小,Raulin,培养基,变化，如氧、氮、氯、硫等元素的加入，或在产

11、物氧化水平上的,葡萄糖,5,酒石酸,0.27,酒石酸铵,0.27,磷酸氢二铵,0.04,微小变化都可以导致产生各种各样的次级代谢产物，并且每种类,硫酸镁,0.027,硫酸铵,0.017,硫酸锌,0.005,硫酸亚铁,0.00,型的次级代谢产物往往是一群化学结构非常相似的不同成分的混,合物。例如，目前已知的新霉素有,4,种，杆菌肽、多粘菌素分别有,Czapek,Dox,培养基,有,10,多种，而放线菌素有,20,多种等,葡萄糖,5,硝酸纳,0.2,磷酸氢二钾,0.1,氯化钾,0.05,硫酸,镁,0.05,硫酸亚铁,0.001,次级代谢产物一般对产生者自身的生命活动无明确功能，不是机,体生长与繁殖

12、所必需的物质，也有人把超出生理需求的过量初级,初级代谢与初级代谢的关系,代谢产物也看作是次级代谢产物,1,存在范围及产物类型不同,次级代谢产物通常都分泌到胞外，有些与机体的分化有一定的关,系，并在同其它生物的生存竞争中起着重要的作用,2,对产生者自身的重要性不同,许多次级代谢产物通常对人类和国民经济的发展有重大影响,初级代谢产物，如单糖或单糖衍生物、核苷酸、脂肪酸等单体,以及由它们组成的各种大分子聚合物，蛋白质、核酸、多糖,脂类等通常都是机体生存必不可少的物质，只要在这些物质的,合成过程的某个环节上发生障碍，轻则引起生长停止、重则导,致机体发生突变或死亡,次级代谢产物对于产生者本身来说，不是机

13、体生存所必需的物质,即使在次级代谢的某个环节上发生障碍。不会导致机体生长的,停止或死亡，至多只是影响机体合成某种次级代谢产物的能力,初级代谢与初级代谢的关系,1,存在范围及产物类型不同,2,对产生者自身的重要性不同,3,同微生物生长过程的关系明显不同,初级代谢自始至终存在于一切生活的机体中，同机体的生长,过程呈平行关系,次级代谢则是在机体生长的一定时期内（通常是微生物的对数生,长期末期或稳定期）产生的，它与机体的生长不呈平行关系，一,般可明显地表现为机体的生长期和次级代谢产物形成期二个不同,的时期,初级代谢与初级代谢的关系,1,存在范围及产物类型不同,2,对产生者自身的重要性不同,3,同微生物

14、生长过程的关系明显不同,4,对环境条件变化的敏感性或遗传稳定性上明显不同,初级代谢产物对环境条件的变化敏感性小（即遗传稳定性大,而次级代谢产物对环境条件变化很敏感，其产物的合成往往因环,境条件变化而停止,初级代谢与初级代谢的关系,1,存在范围及产物类型不同,2,对产生者自身的重要性不同,另外，催化次级代谢产物合成的酶往往是一些诱导酶，它们是,在产生菌对数生长末期或稳定生长期里，由于某种中间代谢产,3,同微生物生长过程的关系明显不同,物积累而诱导机体合成的一种能催化次级代谢产物合成的酶,这些酶通常因环境条件变化而不能合成,4,对环境条件变化的敏感性或遗传稳定性上明显不同,5,相关酶的专一性不同,相对来说催化初级代谢产物合成的酶专一性强，催化次级代谢,产物合成的某些酶专一性不强，因此在某种次级代谢产物合成,的培养基中加入不同的前体物时，往往可以导致机体合成不同,类型的次级代谢产物,初级代谢与初级代谢的关系,初级代谢是次级代谢的基础，它可以为次级代谢产物合成提供,1,存在范围及产物类型不同,前体物和所需要的能量,2,对产生者自身的重要性不同,初级代谢产物合成中的关键性中间体也是次级代谢产物合成中,的重要中间体物质,3,同微生物生长过程的关系明显不同,而次级代谢则是初级